《Fermentation》：Preliminary Screening of Non-Conventional Yeasts for Olive Mill Wastewater Valorization
Gabriella Siesto,
Rocchina Pietrafesa,
Antonio Caporusso,
Giorgia La Rocca,
Grazia Alberico,
Vito Valerio and
Angela Capece
编辑推荐：
为应对高污染、高酚含量的橄榄油废水(OMWW)处理难题，本研究系统筛选了41株非传统酵母菌，评估其在合成培养基及OMWW添加条件下的油脂积累潜力、脱毒(降酚、脱色)能力及脂肪酶活性。结果表明，Candida tropicalis AII122和Pichia manshurica ML-3在合成培养基中油脂积累最高(>20%)，在OMWW中C. tropicalis AII122展现出最强的降酚(40.35%)和脱色(41.78%)能力。该研究为基于循环生物经济框架的OMWW资源化提供了有价值的微生物种质资源。
在地中海地区，橄榄油产业是重要的经济支柱，但其生产过程中会产生大量副产品——橄榄油废水(Olive Mill Wastewater, OMWW)。这种废水含有高浓度的有机物、酸性pH值，尤其是大量的酚类化合物，使其具有植物毒性和深色特征，若不经处理直接排放，将对土壤和水体环境造成严重污染。传统的物理化学处理方法成本高且可能产生二次污染，因此，寻找环境友好、可持续的生物处理策略迫在眉睫。与此同时，从微生物中获取“单细胞油脂(Single-Cell Oils, SCOs)”用于生产生物燃料、食品和饲料添加剂，是生物技术领域的热点。能否将OMWW的脱毒处理与有价值的微生物油脂生产结合起来，实现“变废为宝”？这成为了循环生物经济框架下一个极具吸引力的科学命题。为此，研究人员将目光投向了自然界中丰富但尚未被充分开发的微生物资源——非传统酵母菌。它们可能蕴藏着比常规模式菌株更优异的耐受性或代谢能力。发表在《Fermentation》上的这项研究，正是为了系统挖掘这些“微生物矿藏”在OMWW资源化方面的双重潜力。
本研究主要运用了以下几项关键技术方法：1. 菌株筛选与培养：研究以41株来自巴西利卡塔大学酵母菌种保藏中心(UBYC)的非传统酵母菌为对象，以两种模式产油酵母Yarrowia lipolytica ATCC 46483和Lipomyces tetrasporus Li-0407作为阳性对照。2. 表型鉴定技术：采用苏丹黑B(Sudan Black B)染色法在光学显微镜下对酵母细胞内脂滴进行定性观察和初步分组；通过三丁酸甘油酯琼脂(Tributyrin Agar, TBA)平板扩散法测定菌株的脂肪酶活性。3. 定量分析技术：在限氮条件下培养后，通过酸热法破碎细胞，使用己烷:甲醇混合溶剂萃取脂质，并通过重量法精确测定细胞内总脂质含量(以占细胞干重的百分比表示)。4. OMWW脱毒效能评估：将筛选出的菌株在添加了不同比例(15%, 25%, 50% v/v)OMWW的培养基中培养，通过测量培养前后在395 nm处的吸光度变化来评估废水脱色率，并采用福林-肖卡法(Folin-Ciocalteau method)测定总酚含量变化，以此计算酚类化合物去除率。
3.1. 橄榄油废水的化学成分
OMWW的成分高度可变，通常呈酸性，含有大量糖类、脂质、蛋白质和酚类化合物。研究首先对所用OMWW样本进行了生化参数表征，其结果与文献报道一致，为后续将其用作培养基底物奠定了基础。
3.2. 酵母菌株积累SCOs的定性筛选
利用苏丹黑B染色技术对41株酵母在限氮条件下的脂质积累能力进行初步筛查。显微镜观察显示，许多酵母能在细胞质内积累被染成蓝色的脂滴。根据脂滴存在的普遍程度，菌株被分为两组：第一组仅部分细胞含脂滴；第二组则所有细胞均含脂滴，包括对照菌株在内的后者被视作潜在的油脂生产者。
3.3. SCOs的定量生产
为了确认定性筛选结果并筛选潜在产油菌株，在限氮条件(C/N = 60 g/g)下对菌株进行培养并定量提取脂质。定量分析显示，不同菌株的脂质积累能力差异显著。Candida tropicalis AII122和Pichia manshurica ML-3表现出最高的脂质含量，分别达到细胞干重(Dry Cell Weight, DCW)的33.3%和29.4%，超过了界定产油微生物的20%阈值。Meyerozyma caribbica AII171和Debaryomyces hansenii RB5的脂质含量也分别达到25.0%和22.2%。而其他菌株的脂质积累量在6.25%至19.05%之间，属于中度或弱产油类型。
3.4. 脂肪酶活性的测定
脂肪酶能将外源油脂水解为脂肪酸供细胞吸收，对利用OMWW中可能的油脂成分或进行“外源合成”(ex novo lipid synthesis)很重要。通过TBA平板扩散法评估了所有菌株的脂肪酶活性。结果表明，大多数菌株在培养48或72小时后能形成透明水解圈，活性存在菌株差异和时间依赖性。其中，菌株M (Y. lipolytica)、RB5 (D. hansenii)和D (Pichia nakasei)在72小时后的水解圈直径最大(分别为10、9和6 mm)。而菌株ND1和ML-3未检测到脂肪酶活性。
3.5. 在OMWW基质中生长的酵母菌株的油脂生产
基于上述筛选结果，选择了8株菌(AII122, ML-3, AII171, RB5, M, AII110, D, 2R1)在添加了不同浓度OMWW的酵母麦芽肉汤(Yeast Malt Broth, YMB)培养基中进一步评估。生长实验表明，15% (v/v)的OMWW添加量对大多数菌株生长抑制最小甚至有所促进，因此被选为后续实验浓度。然而，在此条件下培养后，所有菌株的细胞内脂质积累量均大幅降低，仅介于约1%至6.48%之间，远低于产油酵母阈值。脂质积累最高的菌株是Metschnikowia pulcherrima 2R1 (6.48%)。研究表明，OMWW中的酚类等抑制物可能迫使细胞将代谢能量转向解毒和应激保护，而非脂质存储。48h ? Abs0h) by the yeast strains grown in OMWW (15%, 25%, 50%, v/v) in comparison to YMB medium without OMWW addition. Letters (a, b, ab, ac) indicate significant differences among treatments within each strain (p < 0.05).">
3.6. 潜在产油酵母对OMWW基质脱色和多酚含量降低的影响
OMWW的脱毒效果通过脱色率和总酚去除率来衡量。在8株测试菌中，C. tropicalis AII122表现最为突出，其酚类化合物去除率和脱色率分别达到40.35%和41.78%，显著高于至少一种对照菌株。Mey. caribbica AII171也能有效降低酚类含量(37.07%)，但未观察到明显脱色，表明其可能选择性代谢了不贡献颜色的特定酚类。其他菌株的脱毒效果各有差异。
本研究得出结论，非传统酵母菌是用于OMWW价值化的宝贵生物资源。虽然在高酚含量的原始OMWW基质中直接诱导高产油脂面临挑战，但筛选出的菌株，特别是Candida tropicalis AII122，展示了出色的OMWW脱毒能力（高效降酚和脱色）以及在适宜合成条件下强大的油脂积累潜力。这证明将环境修复与资源生产相结合的“微生物细胞工厂”策略是可行的。例如，AII122菌株可被视为一个多功能候选菌株，其强健的生长适应性和高效的脱毒能力，为后续通过过程优化（如培养基改良、发酵条件控制）来提升其在OMWW中的油脂产率奠定了坚实基础。该研究不仅为OMWW的可持续管理提供了新的微生物解决方案，也凸显了挖掘本土微生物多样性对于推动循环生物经济发展的重要意义。未来研究可专注于优化培养策略以克服OMWW的抑制效应，并探索这些酵母菌在规模化生物炼制过程中的应用潜力。
