乙酰羟酸合成酶的调节亚基能够增强其催化亚基对2-酮丁酸的催化作用

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：The regulatory subunit of acetohydroxyacid synthase enhances the catalysis of its catalytic subunit on 2-ketobutyrate

乙酰羟酸合酶（AHAS）全酶及催化亚基的制备与催化特性研究表明，E. coli、S. cerevisiae、B. subtilis和P. syringae pv. Tomato DC3000来源的AHAS全酶及催化亚基在丙酮酸底物下催化活性相近，而2-酮丁酸底物下调节亚基通过稳定关键中间体和促进底物结合显著提升催化效率，揭示了AHAS亚基间结构-功能关联，为酶定向进化提供理论依据。

　　

郑子琪|魏兆天|金世波|姚振振|马灿霞|高文云|李恒

西北大学生命科学学院，中国陕西省西安市太白北路229号，邮编710069

摘要

乙酰羟酸合成酶（AHAS）是支链氨基酸生物合成途径中的限速酶，由催化亚基（CSU）和调节亚基（RSU）组成。在本研究中，我们利用不同的方法制备了来自大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和番茄致病假单胞菌 pv. DC3000的AHAS全酶。此外，我们使用丙酮酸和2-酮丁酸（2-KB）作为底物，研究了这四种全酶及其相应催化亚基的催化特性。结果表明，这八种酶（四种全酶加上四种催化亚基）在丙酮酸测定中的催化活性相当，表明调节亚基的存在似乎并不显著影响蛋白质的催化作用；而在2-酮丁酸（2-KB）测定中，调节亚基在促进底物识别以及通过稳定关键中间体羟丙基-ThDP来引导底物缩合反应方面起着重要作用。这些观察结果加深了我们对AHAS全酶与其催化亚基和调节亚基之间结构与功能关联的理解。此外，这些发现也为未来改进这些蛋白质的催化效率并拓宽其底物谱提供了理论基础。

引言

支链氨基酸（BCAAs），包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，是细菌、真菌和植物中不可或缺的代谢物，在蛋白质生物合成、细胞生长和对环境压力的响应中起着核心作用[1]、[2]。由于BCAAs的生物合成途径是植物中的关键代谢途径之一，因此它也是最重要的除草剂靶标之一[1]、[3]。实际上，农业领域广泛使用的除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶硫苯甲酸酯类和磺酰氨基羰基三唑啉酮类等，都针对该途径中的关键限速酶乙酰羟酸合成酶（AHAS）[1]。此外，该途径在几乎所有形式的微生物中都起着关键作用，而在人类体内不存在，因此它也是目前非常有前景的抗菌药物靶标[4]。AHAS是BCAAs生物合成途径中的第一个共同酶，它催化两个丙酮酸分子或一个丙酮酸分子与一个2-酮丁酸（2-KB）分子之间的缩合反应，分别生成2-乙酰乳酸（AL）和2-乙酰-2-羟基丁酸（AHB）（图1）[1]、[2]、[5]、[6]、[7]。AHAS是一种典型的硫胺素二磷酸（ThDP）依赖性酶，其活性还依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和Mg²⁺。在催化机制方面，该酶与转酮酶和甲瓦龙酸二磷酸脱羧酶这两种ThDP酶家族的代表性成员具有明显的同源性[8]、[9]。与大多数ThDP酶不同，AHAS不是均质的亚基蛋白，而是一个由两个催化亚基（CSU）和两个调节亚基（RSU）组成的异源四聚体复合物。每个催化亚基都包含完整的催化机制，能够结合ThDP和底物α-酮酸，并是化学反应的主要场所，但其催化活性和稳定性通常比与调节亚基结合的复合物要弱得多[2]、[5]、[9]、[10]。单独的调节亚基没有催化功能，但它通过与催化亚基的相互作用显著影响AHAS的结构稳定性、反应动力学、底物亲和力和终产物反馈抑制。因此，它是AHAS维持其基本生理功能的关键组成部分[11]、[12]、[13]。进一步的研究表明，调节亚基通过调节底物通道、改变ThDP附近的微环境，甚至通过远程构象变化来影响催化亚基活性位点的几何结构[14]、[15]。对植物和细菌中AHAS调节机制的研究也表明，调节亚基在BCAAs代谢途径的适应性平衡中起着关键作用，并参与响应氨基酸浓度变化的代谢调控网络[12]、[16]、[18]。由于AHAS的这种结构特性，制备其全酶通常需要先分别获得其催化亚基和调节亚基，然后在高离子强度储存缓冲液（约1 M磷酸钾）中重新组装它们以保持复合物的活性[19]。为了简化这一过程，我们曾制备了大肠杆菌乙酰羟酸合成酶（EcAHAS-CSU）和海洋热球菌的谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的催化亚基，并评估了它们在有机合成中的可用性[20]、[21]、[22]、[23]。在后续尝试中，我们通过级联策略合成了EcAHAS全酶，将ilvBN基因插入到一个载体中，并对其基本性质及其催化的有机反应进行了表征[24]。

在最近的研究中，我们还建立并评估了两种预柱衍生化-HPLC协议，分别使用4-硝基-o-苯二胺（NPDA）和2,4-二硝基苯肼（DNPH）作为衍生化试剂，以全面测定几种乙酰乳酸合成酶和EcAHAS介导的反应（NPDA/NPDH-HPLC协议）[21]、[24]、[25]、[26]。在对EcAHAS全酶的研究中，我们观察到该酶不仅能够催化两个丙酮酸分子缩合生成AL（其脱羧产物为乙酰醇），还能催化两个2-酮丁酸分子缩合生成2-丙酰-2-羟基丁酸（PHB，其脱羧产物为4-羟基-3-己酮），以及3,4-己二酮（PHB的脱羧产物）和丙醛（丙酮酸的脱羧产物）[24]、[25]。在进一步的研究中，我们制备了更多细菌AHAS全酶及其相应的催化亚基和调节亚基，分析了它们的基本性质，并发现了一些新的催化特性。在这里，我们将讨论我们获得的所有细节。

试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶和其他分子生物学试剂购自Transgen Biotech（北京，中国）。引物由Tsingke Biotechnology Co., Ltd.（北京，中国）合成。FAD、ThDP和IPTG购自J&K Scientific（北京，中国）。SanPrep柱质粒迷你制备试剂盒和SanPrep柱DNA凝胶回收试剂盒购自Bioengineering（上海）有限公司。所有其他化学品均为分析级，购自上海Aladdin

重组蛋白的制备和体外重组

EcAHAS-CSU和EcAHAS全酶的制备遵循已发表的程序[23]、[24]、[25]。实际上，我们能够以级联方式表达EcAHAS全酶的原因在于，在大肠杆菌中，编码AHAS-CSU（ilvB）和RSU（ilvN）的基因以单个操纵子的形式排列，两者之间仅相隔三个核苷酸。此外，ilvN上游没有独立的启动子或典型的Shine-Dalgarno序列。在这种基因组结构下，

结论

总结来说，本研究探讨了微生物来源的AHAS全酶的制备方法，并认识到不同酶的制备方法各不相同。来源于细菌的EcAHAS和BsAHAS可以通过级联表达方式合成，而同样来自细菌的PstAHAS则需要通过其催化亚基和调节亚基的共纯化来制备；而来源于酵母的ScAHAS则需要在其催化亚基和调节亚基在1.15 M磷酸钾缓冲液中重新组装来生成

CRediT作者贡献声明

金世波：数据分析、数据管理。姚振振：方法学研究、数据分析。魏兆天：方法学研究、数据分析、写作-审稿与编辑、写作-初稿撰写、方法学研究、资金获取。马灿霞：数据分析、数据管理。高文云：写作-审稿与编辑、项目监督、方法学研究、资金获取。郑子琪：方法学研究、实验设计、数据分析、概念构建

未引用参考文献

[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号22177091和31971208）和陕西省化学与生物学基础科学研究项目（资助编号23JHQ051）的资助。