KUNITZ型丝氨酸蛋白酶抑制剂rBMTI-6作为肺腺癌的潜在治疗候选物

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：KUNITZ-TYPE SERINE PROTEASE INHIBITOR rBMTI-6 AS A POTENTIAL THERAPEUTIC LEAD FOR LUNG ADENOCARCINOMA

本研究发现重组牛蜱Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂rBmTI-6对A549肺癌细胞具有选择性毒性，通过激活caspase-3诱导凋亡，血清-free条件下活性增强，提示其作为新型抗癌治疗策略的潜力。

　　

Gilmara B. Lima|Everton Nencioni|Fábio Thimoteo|Rafaela F.A. Pinto|Isabella Pierina|Rayssa de M. Lopes|Tiago Rodrigues|Sergio D. Sasaki

ABC联邦大学自然与人类科学中心

摘要

肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一，这突显了迫切需要针对肿瘤相关蛋白水解途径的治疗策略。在这里，我们报告了rBmTI-6的先前未被发现的抗肿瘤活性，rBmTI-6是一种从牛蜱虫Rhipicephalus microplus中提取的重组Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人类肺腺癌模型中表现出抗肿瘤效果。rBmTI-6在Pichia pastoris中异源表达，通过亲和层析法纯化，并进行了生化表征。该重组抑制剂对胰蛋白酶显示出强烈的抑制活性，证实了其作为Kunitz型蛋白酶抑制剂的功能完整性。在细胞实验中，rBmTI-6以剂量依赖的方式显著降低了A549肺腺癌细胞的存活率，同时保持了非肿瘤性人类肺成纤维细胞（MRC-5）的存活率，表现出明显的肿瘤选择性。机制分析显示rBmTI-6主要通过激活caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡。显微镜观察到的形态学变化进一步支持了程序性细胞死亡途径的激活。有趣的是，在无血清条件下，rBmTI-6的细胞毒性显著增强，表明细胞外蛋白质相互作用可能影响其在体外的有效生物利用度。综上所述，这些发现表明rBmTI-6是一种能够选择性诱导肺腺癌细胞凋亡的Kunitz型抑制剂，并强调了其作为开发蛋白酶靶向癌症治疗分子的潜力。

部分摘录

引言

肺癌是全球最具侵袭性的恶性肿瘤之一，每年导致近180万人死亡（IARC，2025年）。除了基因突变和致癌信号传导外，越来越多的证据表明蛋白水解失衡在肿瘤进展中起着关键作用（López-Otín和Matrisian，2007年；Kim等人，2008年；List，2009年；Eatemadi等人，2017年）。特别是丝氨酸蛋白酶参与了细胞外基质的降解、血管生成和免疫调节。

材料与方法

使用含有rBmTI-6 cDNA的重组表达载体BmTI6-pPIC9K，通过电穿孔（2 μF，400 Ω，1,5 kV）将基因导入Pichia pastoris GS115中。在最小葡萄糖琼脂（MD）上筛选阳性克隆，并在BMGY培养基中于28°C培养至光密度（OD₆₀₀）达到2–6。通过在BMMY培养基中每天添加1%甲醇120小时来诱导表达。含有分泌的rBmTI-6的培养上清液通过离心（10,000

rBmTI-6的表达与纯化

rBmTI-6在Pichia pastoris GS115中成功表达，并在甲醇诱导后分泌到培养基中。使用胰蛋白酶-琼脂糖柱进行亲和纯化，得到一个与抑制剂相对应的单一洗脱峰，SDS-PAGE分析显示该抑制剂由两条带组成（22 kDa和9 kDa），数据未显示。如图2所示，r-BmTI-6对牛胰蛋白酶具有抑制活性，其Ki值通过Morrison分析确定。这些结果证明了

讨论

开发更有效和更具选择性的治疗剂仍然是癌症研究中的主要挑战，尤其是在肺癌治疗方面，肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管已在不同肿瘤模型中研究了Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，但只有少数蜱虫来源的成员（最著名的是Amblyomin-X（Morais等人，2023年）显示出抗肿瘤潜力。

结论

从Rhipicephalus microplus中提取的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂rBmTI-6对A549肺腺癌细胞具有选择性细胞毒性，同时对正常成纤维细胞无害。该分子通过激活caspase-3诱导凋亡，在最高浓度下仅有轻微的坏死成分，表明其作用机制具有多样性。鉴于其纳摩尔级的效力、肿瘤选择性和生物技术可行性，rBmTI-6作为一个有前景的原型

作者贡献声明

Rayssa de M. Lopes：方法学、研究、数据分析。Sergio Daishi Sasaki：写作-审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。Tiago Rodrigues：资源管理、方法学、研究、数据分析。Gilmara B. Lima：写作-审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证。

未引用参考文献

Foster等人，1998年。

资金来源

本研究得到了高等教育人员培训协调委员会（CAPES，项目编号001）和圣保罗州研究基金会（FAPESP，项目编号2018/11874-5）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢ABC联邦大学（UFABC）、圣保罗州研究基金会（FAPESP）、国家科学技术发展委员会（CNPq）以及高等教育人员培训协调委员会（CAPES）对本工作的支持。作者还感谢圣保罗大学医学院（FMUSP）的Mariangela Macchione博士提供A549细胞，以及圣保罗联邦大学的Maria Cristina Carlan da Silva博士的帮助。