分子伴侣与溶解性标签：使重组fibEase在治疗应用中的产量提高了34倍

《Protein Expression and Purification》：Molecular Chaperones and Solubility Tags: A 34-Fold Increase in Recombinant fibEase Yield for Therapeutic Applications

海洋来源纤溶酶fibE通过密码子优化、溶氧性增强标签、分子伴侣及工艺优化策略，在E. coli中实现高效表达，酶活性达12294 U/mL，较优化前提升34倍，验证了分子伴侣促进正确折叠及标签纯化后脱落的机制，为血栓治疗提供新方向。

　　

车志群|魏素媛|孙仁杰|郭春

中国广西百色右江民族医学院医学技术与人工智能学院，533000

摘要：

经过密码子优化后，源自海洋的fibE在大肠杆菌中成功实现了细胞内表达。为了提高产量，采用了一种组合策略，包括密码子优化、增溶性标签、分子伴侣蛋白和工艺优化。优化后，重组菌株的纤溶酶活性达到了每单位发酵液体积12294 U/mL，是优化前的34倍。

对含有和不含有分子伴侣蛋白的重组大肠杆菌进行差异表达分析，以验证其功能。研究表明，分子伴侣蛋白有助于目标蛋白的正确折叠和可溶性表达。随后，分子伴侣蛋白和增溶性标签同时解离，从而减少了在第二步纯化过程中由凝血酶介导的切割和标签去除可能造成的损失。由于是一种依赖金属离子的丝氨酸蛋白酶，它在体外不会引起溶血，并且能够直接降解纤维蛋白。本研究中描述的组合优化方法可以用于其他难以表达的蛋白质的表达。最后，其优异的酶学特性表明它在血栓形成预防和治疗方面具有潜在的应用价值。

引言

血管中的纤维蛋白沉积会促进血栓形成，这是许多心血管疾病的主要原因和结果。尽管传统的溶栓剂仍然是治疗血栓的金标准，但它们受到血浆半衰期短、纤维蛋白特异性低和成本高的限制^[1]。因此，迫切需要开发新型、更安全的溶栓剂。相比之下，微生物纤维酶具有较高的产率、低制造成本，并适合工业化生产。迄今为止，关于纤溶酶的研究主要集中在蛇^[2]、蚯蚓^[3],植物^[5],真菌Cordyceps militaris^[6]和微生物^{[7], [8]等方面，而针对海洋微生物的研究较少。值得注意的是，海洋微生物能够在pH值与人体内部环境相似的极端海洋环境中生存。因此，海洋微生物是具有药用价值的生物活性化合物的宝贵来源[9]，已从中分离出多种具有多种生物活性的次级代谢产物，包括抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗真菌和抗凝血作用[10]。}

原始的fib（GenBank: KM519994.1）来源于先前鉴定的一种海洋枯草芽孢杆菌 D21，该菌株是从潮间带红树林沉积物中分离得到的。为了解决枯草芽孢杆菌 D21菌株中纤溶酶产率低（279 U/mL）和纯化效率差的问题，我们采用了在大肠杆菌（E. coli）中的异源表达方法，以实现高效的大规模生产和下游纯化。E. coli是重组蛋白生产的主要经典表达系统。该系统不仅易于操作，培养条件可控，而且表达效率高、生长迅速。因此，它常被用于快速、经济高效的重组蛋白生产[11], [12], [13], [14]。尽管有这些优势，但在大肠杆菌中表达异源蛋白仍然面临一个主要挑战，即容易形成不溶性和无功能的包涵体[15], [16]。早期研究表明，多种因素会影响大肠杆菌中异源蛋白的产率和可溶性，包括培养基组成、宿主菌株选择、诱导温度^[17]和诱导剂浓度^[18]。值得注意的是，最近人们对用于纤溶酶原的大肠杆菌表达系统给予了广泛关注。提高可溶性蛋白的表达通常需要对关键因素进行系统的多参数优化，这可以显著减少包涵体的形成^[19]。然而，在许多情况下，包涵体的形成问题仍未得到解决^[7]。包涵体蛋白的溶解和重折叠过程复杂，无法提高蛋白产量和活性，这仍然是全球面临的重大挑战^[20]。

尽管大肠杆菌的蛋白质产率较高，但由于不溶性包涵体的形成以及菌株特异性和产物特异性的问题（如启动子强度、IPTG诱导和氧气需求），仍需进一步优化其表达。为此，本研究采用了遗传工程和工艺工程等策略。系统优化通常需要结合多种方法，如密码子优化、共表达增溶性标签或分子伴侣蛋白、工艺优化等。其中，密码子优化被广泛用于高效表达异源蛋白。它涉及用常见密码子替换稀有密码子、优化GC含量和mRNA二级结构，并避免不希望出现的顺式作用元件。密码子优化通过精确匹配宿主的tRNA池来提高密码子的使用效率，从而实现高效和准确的翻译，同时增强mRNA的稳定性和序列兼容性^[21]。近年来，随着合成生物学和基因工程的进步，密码子优化已成为重组蛋白表达的关键步骤，并已在生物制药生产、工业酶生产和基础研究中得到广泛应用。然而，过度优化可能会损害蛋白质的折叠和功能，因此需要在表达水平和蛋白质活性之间取得平衡。深入研究密码子使用模式及其对基因表达的影响对于推进合成生物学应用具有重要意义。

章节片段

菌株和质粒

所使用的质粒和菌株列于表1中。

fib基因的生物信息学分析和优化

原始的fib（GenBank: KM519994.1）来源于先前鉴定的一种海洋枯草芽孢杆菌 D21。使用NTI、MEGA、TMPRED、Clustal、PRIMER、DNAStar等工具以及在线资源（包括NCBI、SMART、ExPASy和SignalP）进行了生物信息学分析。

为了提高产量，fib基因（包括分子伴侣蛋白和成熟酶）针对大肠杆菌进行了密码子优化，并命名为fibE。

重组大肠杆菌的构建和转化

优化的fibE被合成，

fib的生物信息学分析和密码子优化

生物信息学分析显示，fib基因（GenBank: KM519994.1）全长为1146 bp，编码382个氨基酸（aa），包括一个信号肽（SP）、一个分子伴侣蛋白和一个成熟酶（图S1）。如图S2所示，Fibase含有三个潜在的N-糖基化位点、一个跨膜区域，并表现出亲水性。此外，它还具有属于丝氨酸蛋白酶家族S8的结构和功能域。

讨论

作为异源表达的关键障碍，包涵体的形成是一个全球性的技术难题，其复性过程复杂且成本高昂。虽然引入信号肽可以促进分泌，从而减少包涵体的形成，但通过细胞内表达，可以通过离心和超声处理回收高浓度的目标蛋白，这有助于保存蛋白并提高下游纯化的效率。

结论

密码子使用、增溶性标签和培养工艺的组合优化使得fibEase在大肠杆菌中的细胞内表达产量达到12,294 U/mL，验证了这一策略的有效性。在16°C下用0.2 mM IPTG诱导24小时后，重组大肠杆菌 BL21 (DE3)/pGEX-KG-fibE的纤溶酶活性达到了每单位发酵液体积12294 U/mL。这一数值是优化前的34倍，代表了最高的纤溶酶活性水平。

CRediT作者贡献声明

车志群：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目管理，方法学，资金获取。魏素媛：撰写 – 原稿，概念构思。孙仁杰：监督，数据管理。郭春：撰写 – 审稿与编辑，监督