来自海洋细菌Cellulophaga sp. P-1的κ-卡拉胶酶的克隆、表达及其生化特性研究

《Protein Expression and Purification》：Cloning, expression, and biochemical characterization of κ-carrageenase from marine bacterium Cellulophaga sp. P-1

从大连海带中分离的 Cellulophaga sp. P-1 检测到新型冷适应 κ-角叉菜糖苷酶 Car2891，该酶在大肠杆菌中高效表达，最适活性温度30℃、pH8.0，0-30℃保持稳定，金属离子协同激活，Mg2?/Na?最佳，KM 6.1 mg/mL，Vmax 31.65 mg/mL·min?1，经动力学分析为内切型降解机制，最终产物以四糖和二糖为主，为绿色制备功能寡糖提供新工具。

　　

林盼|张亚文|王哲|张亚莉|姜兰|邹浩|杨友聪|王晓辉

中国辽宁省大连市大连大学生命与健康学院

摘要

从从Chondrus中分离出的海洋细菌Cellulophaga sp. P-1中鉴定出一种新型的耐寒κ-卡拉胶酶（Car2891）。该酶在E. coli BL21(DE3)中进行了重组表达，并对其进行了生化特性分析。Car2891在30°C和pH 8.0条件下表现出最佳活性，在中性至弱碱性条件下从0°C到30°C范围内保持高稳定性和催化性能。Na⁺、Mg²⁺和Mn²⁺可增强其活性，而Hg²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和EDTA则会强烈抑制其活性。动力学分析显示，其对κ-卡拉胶的K_m值为6.1 mg mL^?1，V_max值为31.65 mg mL^?1 min^?1。水解模式分析表明其具有内切作用机制，最初产生六糖和四糖，最终主要产物为二糖和四糖。这些特性表明Car2891作为一种高效且可控的生物催化剂，在环保处理κ-卡拉胶和大规模生产功能性寡糖方面具有潜力。

引言

κ-卡拉胶是一种从红藻中提取的硫酸化线性多糖，由于其优异的凝胶形成、增稠和稳定性能，在食品、制药和化妆品行业得到广泛应用[[1], [2], [3]]。然而，由于其大分子结构的固有局限性（如溶解度低和口服生物利用度低），κ-卡拉胶的实际应用受到很大限制。相比之下，κ-卡拉胶寡糖不仅具有显著提高的水溶性 và 更好的吸收性，还具备多种生物活性功能，包括抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用[4]。因此，它们被视为未来功能性食品和生物医学领域应用的有希望的候选物质。与传统化学降解方法（会产生许多副产物、造成严重污染并容易破坏硫酸基团）相比，酶促水解具有条件温和、底物特异性强、产物分子量分布均匀以及有效保留活性基团等优点，被认为是制备高活性κ-卡拉胶寡糖的绿色优选方法[[5], [6], [7]]。在这种背景下，作为降解κ-卡拉胶的关键工具酶，κ-卡拉胶酶（EC 3.2.1.83）在其开发和应用方面受到了广泛关注。

在这方面，负责降解κ-卡拉胶的κ-卡拉胶酶（EC 3.2.1.83）引起了广泛的研究兴趣。目前关于κ-卡拉胶酶的研究已经取得了显著进展。该酶主要属于糖苷水解酶家族16（GH16），已从超过10个属的微生物中鉴定出25多个基因序列。其典型的β- jelly roll结构和用于水解β-(1 → 4)键的双置换保留机制已有详细记录[8,9]。然而，大多数报道的κ-卡拉胶酶存在酶活性低和热稳定性差的挑战，这严重阻碍了它们的工业应用。值得注意的是，由在永久寒冷环境中（例如极地地区、深海）生存的微生物产生的耐寒酶在低温至中等温度（0–30°C）下表现出高催化效率。这与其在分子水平上的结构灵活性增强有关，这种灵活性通过减少盐桥数量、降低氢键网络密度、增加表面亲水性以及提高甘氨酸残基含量等机制实现[[10], [11], [12]]。这些独特性质使得耐寒酶特别适用于节能的工业过程或处理热不稳定材料[[13], [14], [15]]。

尽管Cellulophaga属已被认为是卡拉胶酶的来源，但对来自寒冷海洋环境的Cellulophaga菌株中的κ-卡拉胶酶的系统研究仍然很少。因此，本研究的主要研究空白是对耐寒κ-卡拉胶酶的探索不足，特别是来自嗜冷Cellulophaga物种的酶。为了解决这一问题，本研究聚焦于从寒冷海洋环境中分离出的Cellulophaga菌株。我们的目标是克隆其κ-卡拉胶酶基因，在E.coli中实现高效异源表达和纯化，并系统地表征重组酶的生化特性。此外，我们还旨在确定其水解产物的寡糖组成。本工作的创新之处在于：[1]从耐寒Cellulophaga菌株中探索和表征了一种新型κ-卡拉胶酶，扩展了此类酶的资源库[2]；[2]重点研究了该酶的耐寒催化特性，为低温生物过程提供了新的生物催化剂候选物；[3]生成了关于其酶特性和产物的基础数据，有助于更深入地理解耐寒卡拉胶酶的催化和适应机制。这项研究不仅为在温和条件下绿色生产生物活性κ-卡拉胶寡糖提供了潜在的新工具，还为利用耐寒酶资源在生物技术中的应用提供了重要的实验数据。

部分摘录

样品收集

样品来自中国辽宁省大连市经济技术开发区的海北广场（121°45′59.41″E, 39°2′17.13″N）。样品在使用前储存在-80°C。

样品处理

新采集的Chondrus样品用无菌海水彻底清洗以去除表面杂质，然后切成大约0.5厘米×0.5厘米的小块。将这些组织片段接种到含有2克/升卡拉胶和20克/升钠的富集培养基中

菌株P-1的鉴定

使用卢戈尔碘染色法（图1a）从Chondrus样品中初步筛选出三种能够降解卡拉胶的候选菌株。为了进一步评估它们的酶活性，通过DNS方法测量了所有三种野生型菌株在25°C下的胞外κ-卡拉胶酶活性。最终选择活性最高的菌株P-1进行后续表征（补充材料S1）。

革兰氏染色后进行显微镜观察

结论

在这项研究中，从中国大连沿海地区采集的Chondrus样品中分离出一种产生高水平κ-卡拉胶酶的海洋细菌Cellulophaga sp. P-1。从其基因组中成功克隆出了重组酶Car2891，并实现了高效表达。Car2891在30°C时表现出最大活性，并在0–30°C范围内保持良好的热稳定性，表明它是一种耐寒酶。其最佳反应pH值为8.0，且表现出优异的

CRediT作者贡献声明

林盼：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，研究，正式分析。张亚文：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究。王哲：撰写 – 审稿与编辑，正式分析。张亚莉：撰写 – 审稿与编辑，研究，正式分析，概念化。姜兰：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念化。邹浩：可视化，方法学，研究，正式分析。杨友聪：

伦理批准、参与同意和发表同意

不适用。

资助

本工作得到了中央引导地方科技发展基金项目、国家自然科学基金青年科学基金项目和大连青年科技之星项目的支持。

利益冲突

本手稿是我们的原创工作，此前未发表过，目前也没有在其他地方接受发表审议。所有作者都对研究和手稿做出了实质性贡献，已批准最终版本提交，并同意对工作的所有方面负责。所呈现的数据是真实的，没有经过伪造或不当操作。与本工作无关的利益冲突。

致谢

我们衷心感谢大连大学提供的实验设施以及中国科学院大连化学物理研究所提供的MALDI-TOF仪器。