利用时间分辨拉曼光谱解析硫磺素T的超快电荷转移动力学

《ACS Physical Chemistry Au》：Ultrafast Charge Transfer Dynamics of Thioflavin T Probed by Time-Resolved Raman Spectroscopy

为解决硫磺素T（ThT）分子内电荷转移（ICT）过程中结构变化的直接实验证据缺失问题，研究人员通过飞秒受激拉曼光谱（FSRS）和瞬态受激拉曼光谱（ISRS），揭示了ThT在激发态ICT过程中苯并噻唑基团的弯曲和二甲基苯胺基团的扭转等结构演变动力学，为理解ThT与淀粉样纤维结合后的荧光增强机制提供了关键结构动力学依据。

　　

硫磺素T（Thioflavin T，简称ThT）是一种在生物医学研究中广泛应用的荧光染料，尤其以其对淀粉样纤维（amyloid fibrils）的特异性结合和高灵敏度检测而闻名。淀粉样纤维与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病密切相关，因此ThT常被用作这类疾病相关蛋白聚集体的重要探针。有趣的是，ThT的荧光性质对其分子构象和微环境变化极为敏感：当ThT与淀粉样纤维结合时，其荧光会显著增强；而在水溶液或脂肪醇等极性溶剂中，其荧光则被强烈淬灭。这种显著的荧光差异被认为与ThT分子在激发态发生的分子内电荷转移（Intramolecular Charge Transfer，简称ICT）过程密切相关。然而，尽管ICT过程被认为是导致ThT荧光淬灭的关键机制，但长期以来，ThT在ICT过程中具体的分子结构变化（例如苯并噻唑基团的弯曲和二甲基苯胺基团的扭转）一直缺乏直接的实验证据。以往的研究多依赖于飞秒瞬态吸收（Transient Absorption，简称TA）和荧光光谱等时间分辨光学手段，这些方法能够探测激发态的电子态动力学，但对分子结构的直接解析能力有限。因此，如何直接观测并阐明ThT在ICT过程中的实时结构演变，成为理解其荧光开关机制和拓展其作为分子转子（molecular rotor）探针应用的关键科学问题。

为解决这一难题，研究人员在《ACS Physical Chemistry Au》上发表了题为“Ultrafast Charge Transfer Dynamics of Thioflavin T Probed by Time-Resolved Raman Spectroscopy”的研究论文。该工作通过结合飞秒受激拉曼光谱（Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy，简称FSRS）和瞬态受激拉曼光谱（Impulsive Stimulated Raman Spectroscopy，简称ISRS）这两种具有超高时间分辨率（<50 fs）和光谱分辨率（<10 cm^-1）的时间分辨振动光谱技术，首次在分子振动层面直接捕捉并解析了ThT在激发态ICT过程中的结构动力学演变。研究不仅证实了ICT过程涉及的多维结构坐标变化，还将结构演变动力学与溶剂粘度依赖性联系起来，并通过时间依赖密度泛函理论（Time-Dependent Density Functional Theory，简称TDDFT）计算对实验结果进行了理论验证，为从分子结构基础理解ThT的荧光调控机制提供了坚实的实验和理论依据。

为开展此项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，利用飞秒瞬态吸收光谱（TA）在403 nm激发下，对ThT在水和一系列脂肪醇溶液中的激发态动力学进行了全局分析，获得了演化相关差分光谱（EADS）和关键时间常数。其次，核心实验采用了两种先进的时间分辨拉曼光谱技术——飞秒受激拉曼光谱（FSRS）和瞬态受激拉曼光谱（ISRS）。FSRS实验使用窄带皮秒拉曼泵浦（802 nm）和宽带拉曼探针（830-930 nm）来获取激发态拉曼光谱。ISRS实验则采用基于非共线光学参量放大产生的超短脉冲（~20 fs）作为拉曼泵浦/探针，通过测量时域干涉信号并经傅里叶变换获得频域振动光谱。所有光谱测量均对ThT在不同溶剂（水、甲醇、乙醇、1-丙醇等）中的样品进行。最后，研究结合了TDDFT计算，在CAM-B3LYP/6-311G(d,p)和B3LYP/6-311G(d,p)水平上，利用导体极化连续模型（CPCM）模拟了1-丙醇溶剂中ThT在激发态的部分平面几何（P*）和扭曲ICT几何（T*），并计算了振动重组能，以解释实验观测到的振动光谱。

飞秒瞬态吸收测量结果

通过分析ThT在水和脂肪醇中的TA光谱，研究发现其激发态动力学表现出强烈的溶剂粘度依赖性。全局分析得到了三个演化相关差分光谱（EADS），对应三个时间常数（τ₁, τ₂, τ₃）。其中，最快的τ₁（约0.3-0.98 ps）代表S₁局域激发（LE）态或Franck-Condon（FC）区的振动弛豫，形成中间态S₁-LE′；τ₂（约1.2-10.0 ps）代表ICT过程；最慢的τ₃代表S₁-ICT态的布居衰减。Kramer-Smoluchowski关系分析表明，τ₁和τ₂均与溶剂粘度相关，斜率α分别为0.67和1.09，提示振动弛豫是无势垒过程，而ICT过程则受粘度显著影响。t和θ_b分别表示二甲基苯胺基团的扭转角和苯并噻唑基团的弯曲角；(b) 水中ThT的TA全局分析得到的EADS；(c) TA测得的时间常数τ₁和τ₂的溶剂粘度依赖性。">

飞秒受激拉曼光谱测量结果

在1-丙醇中进行的FSRS测量获得了ThT的时间分辨激发态拉曼光谱。全局分析同样得到三个动力学分量（0.3, 4.2, 65 ps），与TA结果一致。研究发现，代表ν_8a（苯环/苯并噻唑）的1573 cm^-1谱带和代表ν_8b（苯并噻唑）的~1540 cm^-1谱带在~0.3 ps时间内表现出相反的强度变化和相干振荡，振荡周期对应~99和~196 cm^-1的低频模式，表明ICT坐标与苯并噻唑基团的低频面外弯曲模式强耦合。1573 cm^-1谱带在~0.3 ps内的红移也被解释为结构演变的标志。

瞬态受激拉曼测量结果

ISRS测量聚焦于低频区域（<800 cm^-1），成功解析了ThT在1-丙醇中的多个激发态拉曼谱带，包括200 cm^-1（面外弯曲，ν_oop(bt) + δ_CH3）、537 cm^-1（面内变形，ν_ip(bt) + δ_CH/CH3）和624 cm^-1（ν_ip(ph) + ν_oop(bt)）等。这些谱带的强度变化显示两步动力学：~0.37 ps的增长对应于S₁-LE′中间态的形成，~3.4 ps的衰减对应于ICT过程。同时，473、505、537 cm^-1等谱带在~0.51 ps发生红移，在~4.6 ps发生轻微蓝移，进一步支持了结构先弯曲后扭转的两步模型。

ThT在ICT过程中的结构变化

TDDFT计算优化得到了S₁激发态的两个可能几何结构：部分平面结构P*（θ_t= 19.4°， θ_b= 16.2°）和扭曲ICT结构T*（θ_t= 91.6°， θ_b= 27.1°）。通过计算振动重组能并与实验ISRS谱比较，研究发现0.5 ps时观测到的中间态（S₁-LE′）光谱与P*结构的计算谱高度吻合，表明ICT的第一步是苯并噻唑基团的弯曲。然而，10 ps时观测到的弛豫ICT态光谱与T*结构的计算谱差异较大。尽管T*结构的振子强度极低（~0.003）可解释荧光淬灭，但其清晰的振动特征在FSRS和ISRS中均未明确解析，暗示弛豫的S₁-ICT态可能包含T*几何的贡献，但其振动特征被掩盖或与其它结构共存。1态部分平面结构P*和扭曲ICT结构T*的振动重组能。">

结论与讨论

本研究通过整合FSRS和ISRS两种时间分辨拉曼光谱技术，成功解析了硫磺素T在激发态发生分子内电荷转移过程中的超快结构动力学。实验结果表明，ThT的ICT过程遵循两步结构演变模型：首先是一个快速的（约300-370 fs）过程，涉及苯并噻唑基团的弯曲，形成部分平面的中间几何结构P*；随后是一个较慢的（约3-4 ps）过程，涉及二甲基苯胺基团的扭转，最终趋向于高度扭曲的T*几何结构。ISRS在低频区域观测到的200、537和624 cm^-1等谱带的特异性变化，以及FSRS在高频区域观测到的~1540 cm^-1（ν_8b）谱带的增长，为P*中间态的存在提供了直接的振动光谱证据。TDDFT计算进一步支持了P*结构对应于实验观测的中间态。然而，完全扭曲的T*结构在振动光谱中的特征并不明显，这可能源于其极低的振子强度、光谱重叠或理论计算的功能性依赖等问题。

该研究的重要意义在于，它首次从分子振动层面提供了ThT在ICT过程中结构变化的直接实验证据，将长期以来基于理论推测和间接动力学测量的结构模型置于坚实的实验基础之上。这不仅深化了对ThT这一重要分子转子探针光物理机制的理解，也为精准解释其在淀粉样纤维检测中荧光增强的分子机制（即纤维结合抑制了ICT相关的结构扭转）提供了关键的结构动力学依据。此外，研究所展示的FSRS与ISRS联用策略，为研究其他复杂光化学、光生物过程中的超快结构动力学提供了强大的方法学范例。未来，将此研究框架应用于ThT与淀粉样纤维结合的体系，将有望直接揭示结合如何抑制结构扭转从而增强荧光的分子细节，为神经退行性疾病的早期诊断和药物研发提供更深入的机理见解。