探索屈螺酮与炔雌醇两种性激素与阴道乳杆菌之间的分子互作机制

《Frontiers in Microbiology》：Exploring the molecular crosstalk between the sex steroids drospirenone and ethinylestradiol with vaginal lactobacilli

　　

摘要 引言：阴道微生物群以乳杆菌属（Lactobacillusspp.）为主，在维持阴道稳态和通过产乳酸、分泌抗菌化合物以及竞争性排除病原体来预防感染方面发挥关键作用。虽然已知激素波动会影响微生物组成，但这些相互作用的分子机制仍基本未知。本研究旨在探究合成性激素屈螺酮（drospirenone）和炔雌醇（ethinylestradiol）（激素避孕药的关键成分）对代表性阴道乳杆菌物种的直接效应。 方法：在与不同阴道群落状态类型（CSTs）相关的代表性乳杆菌物种在模拟阴道条件下暴露于屈螺酮和炔雌醇。通过生长测定和RNA-seq转录组分析评估激素暴露后物种特异性转录变化。 结果：在测试的菌株中，卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）PRL2021表现出最显著的转录组调节。在该菌株中，激素处理导致细胞壁生物合成、氨基酸和碳水化合物代谢以及应激适应相关基因上调。具体而言，组氨酸激酶基因sasA_1（可能参与环境感知的双组分调节系统的一部分）表达被诱导。此外，预测参与核黄素（riboflavin）生物合成并与抗氧化防御和黏膜保护相关的ribBA和ribE基因上调。 结论：这些发现表明屈螺酮和炔雌醇可直接调节细菌基因表达，揭示了宿主内分泌信号与阴道微生物群之间一种先前未被充分研究的分子对话。这种相互作用可能有助于维持阴道生态平衡，并对开发针对微生物群的女性健康支持策略具有潜在意义。需进一步研究以阐明激素?微生物群相互作用的更广泛功能后果及其临床相关性。

研究背景与问题

阴道微生物群是维持女性生殖健康的关键因素，其组成以乳杆菌属为主，具有低微生物多样性的特征。健康的阴道微生物群可分为五种群落状态类型（Community State Types, CSTs），其中四种分别由单一乳杆菌物种主导：卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus, CST I）、加氏乳杆菌（L. gasseri, CST II）、惰性乳杆菌（L. iners, CST III）和詹氏乳杆菌（L. jensenii, CST V）。其中，CST I（卷曲乳杆菌主导）被认为与阴道健康状态关联最密切，可能作为健康阴道微生物群的微生物标志物。已知多种生理和环境因素（如月经周期、激素避孕药使用、妊娠、绝经和性活动）会影响阴道微生物组成，而激素波动在其中扮演着核心调节角色。例如，较高的雌激素水平与维持乳杆菌主导的微生物群呈正相关。然而，激素（尤其是合成激素）与阴道乳杆菌之间相互作用的直接分子机制尚不明确。

屈螺酮（DRSP）是一种第四代合成孕激素，具有抗雄激素和抗盐皮质激素特性；炔雌醇（EE）是一种合成雌激素，两者均是激素避孕药的主要成分。它们在调节月经周期之外，也可能对阴道微环境产生直接或间接影响。尽管有研究显示雌激素可促进阴道上皮细胞糖原积累，进而被乳杆菌代谢为乳酸，从而有利于健康阴道环境，但关于这两种特定合成激素如何直接影响代表性阴道乳杆菌的分子通路，目前缺乏系统研究。因此，本研究旨在探究屈螺酮和炔雌醇对阴道微生物群中主要乳杆菌物种的潜在分子作用途径，并确定这些相互作用是否具有物种特异性。

研究方法概览

研究人员选取了分别代表四种主要阴道CSTs的乳杆菌菌株：L. crispatusPRL2021、L. gasseriLMG9203（模式菌株）、L. inersLMG14328（模式菌株）和L. jenseniiV94G。L. gasseri和L. iners的模式菌株来自比利时协调微生物保藏中心，其余菌株分离自先前研究（已获知情同意）。研究首先通过肉汤微量稀释法评估了激素对菌株生长的影响，所用激素浓度范围覆盖了药代动力学报告的最大血药浓度。随后，在模拟阴道流体（SVF）培养基中，对四种菌株分别设置了四种培养条件：无激素对照、仅加EE、仅加DRSP、以及DRSP/EE联合处理，每个条件进行三次生物学重复。在指数生长中期收集细胞，提取总RNA并进行RNA测序（RNA-seq）。测序数据经过质量控制、去除核糖体RNA、比对到参考基因组，并使用EdgeR软件包进行差异表达基因分析（阈值设定为log₂倍数变化≥1且FDR校正p值≤0.05）。对差异表达基因进行了COG（Cluster of Orthologous Groups）功能分类。此外，通过qRT-PCR对L. crispatusPRL2021中关键的差异表达基因（sasA_1、ribBA、ribE）进行了表达量验证。统计分析方法包括用于生长数据比较的非参数Kruskal–Wallis检验和单因素方差分析，以及用于转录组数据分析的EdgeR包。

研究结果

3.1 屈螺酮和炔雌醇对乳杆菌生长的影响

研究人员评估了在涵盖避孕药给药后血浆水平的激素浓度范围内，四种乳杆菌的生长情况。相对于无激素对照，生长变化（以log₂倍数变化表示）大约在-0.5到+0.7之间，表明激素对生长有适度影响，但未观察到统计学显著性。不同菌株反应各异：L. jensenii对两种激素均呈轻微负反应；L. iners的生长随剂量变化而波动明显；L. gasseri显示出双相反应，在高浓度时受刺激，在低浓度时生长受抑制；L. crispatusPRL2021对EE和DRSP的反应也不同，在高浓度EE下生长受抑制，但在生理血浆水平（约1.9 nM）附近恢复正常，而DRSP在高浓度下抑制作用更明显，在低浓度下恢复，但无明确剂量依赖性趋势。总体而言，激素可能通过阈值依赖性生理机制或适应性反应差异性地调节乳杆菌生长，而非直接线性效应。

3.2 激素对乳杆菌转录组的影响

通过RNA-seq分析发现，不同菌株和条件下差异表达基因的数量存在显著差异。L. crispatusPRL2021对激素的反应最为强烈，在各种处理下平均有约100个基因被调节，而L. gasseri、L. jensenii和L. iners的差异表达基因数量较少（分别为13、5和4个），且以下调基因为主。许多被调节的基因在多种激素暴露条件下共享。

COG功能分类显示，上调基因富集在转录（COG-K）、复制与修复（COG-L）、翻译（COG-J）、碳水化合物代谢（COG-G）、细胞壁/膜生物合成（COG-M）等功能类别，以及大量功能未知（COG-S）的基因。下调基因也主要在COG-S类别，并在翻译（COG-J）和无机离子转运（COG-P）类别有显著富集。

鉴于L. crispatus与维持阴道生态平衡的密切关联，且其转录组受激素影响最大，研究人员对该菌株的上调基因进行了深入功能分析。在所有三种实验条件（DRSP、EE、DRSP/EE联合）下，L. crispatusPRL2021中与转录（COG-K）、DNA复制与修复（COG-L）相关的基因显著上调，功能未知（COG-S）的基因也占很大比例（分别占上调转录组的33%、42%和52%）。此外，细胞壁/膜生物合成（COG-M）、碳水化合物代谢（COG-G）和氨基酸代谢（COG-E）相关基因也出现上调。

具体来看，在COG-M类别中，DRSP和EE暴露均诱导了参与肽聚糖生物合成的murG基因表达；DRSP处理还共同上调了相邻的murD基因。在碳水化合物代谢（COG-G）类别中，多个基因在所有处理条件下均上调，涉及阿拉伯糖、D-甘露醇、甘油酸、半乳糖醇、糖原、磷酸甘油酸和肽聚糖代谢的基因，如araD1、mtlF、gpmA5、garK、gtaA2、glgX、pspB2和murQ。在EE暴露下，还观察到编码多重糖结合蛋白（PRL2021_RS04040）的基因上调，该蛋白可能促进糖摄取。氨基酸转运与代谢（COG-E）相关基因（如dapX2、pepT2、thrC、argI、dppE5）也上调，表明激素暴露可能增加了氨基酸周转。

一个有趣的发现是，在所有激素条件下，感知组氨酸激酶基因sasA_1（PRL2021_RS10375）均被上调。该激酶是双组分调节系统（Two-Component System, TCS）的一部分，在乳杆菌中可能参与多种适应过程。在DRSP处理下，sasA_1的上调伴随着应激相关基因（如编码游离甲硫氨酸-R-亚砜还原酶的PRL2021_RS01520）、磷酸盐摄取基因（pstS1、pstB3）以及反应调节蛋白基因agrA（PRL2021_RS10705）的上调。

在EE暴露下，L. crispatusPRL2021中参与核黄素（维生素B₂）生物合成的ribBA和ribE基因（PRL2021_RS07305；PRL2021_RS07300）表达上调。核黄素是能量代谢和抗氧化防御的关键辅因子，对维持阴道黏膜健康具有抗氧化和抗炎特性。在月经期、妊娠期和哺乳期，对核黄素的需求增加。激素诱导的核黄素生物合成基因上调可能代表了L. crispatus的一种适应性优势，增强了其在阴道生态位中的存续和有益作用。通过qRT-PCR验证，证实了sasA_1、ribBA和ribE在相应处理条件下转录水平显著增加。

讨论与结论

本研究评估了屈螺酮和炔雌醇对阴道乳杆菌的潜在直接分子效应。生长测定结果表明，这两种激素可能以阈值依赖性或适应性方式差异性地调节乳杆菌生长。功能基因组分析显示，不同菌株对激素暴露的转录反应存在差异，其中L. crispatusPRL2021受影响最大。在所有三种生长条件下，激素均促进了组氨酸激酶基因sasA_1的表达。在DRSP存在下，该基因表达与应激反应、磷酸盐代谢和转录调节蛋白合成相关基因的上调相关联；而在EE存在下，则与核黄素代谢相关基因的上调相关联。由于核黄素与抗氧化活性和黏膜稳态相关，这一机制可能代表了一个正反馈回路：雌激素不仅通过增加糖原可利用性促进L. crispatus定植，还可能通过增加核黄素产生来增强其对维持阴道生态平衡的功能贡献。

一些基因在激素存在下表达发生改变，但其功能未知，表明可能存在未被认识的机制。总体而言，研究结果表明性激素能以物种和菌株特异性的方式调节乳杆菌的基因表达，很可能是通过与细菌细胞的直接分子相互作用实现的。在L. crispatusPRL2021中观察到的复杂下游信号通路激活，可能构成了其在促进阴道健康中发挥核心作用的基础，尽管这一假说需要进一步的实验验证来阐明这些相互作用的机制基础及其生理相关性。

结论（根据原文翻译）：这些发现表明屈螺酮和炔雌醇可以直接调节细菌基因表达，揭示了宿主内分泌信号与阴道微生物群之间一种先前未被充分研究的分子对话。这种相互作用可能有助于维持阴道生态平衡，并对开发针对微生物群的女性健康支持策略具有潜在意义。需要进一步的研究来阐明激素?微生物群相互作用的更广泛功能后果及其临床相关性。

论文发表信息：本研究发表于《Frontiers in Microbiology》。