《Frontiers in Microbiology》：Genomic insights into within-farm persistence and global phylogenetic relatedness of Shiga toxin-producing Escherichia coli O26 in a dairy cattle farm in the UK
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为探究产志贺毒素大肠杆菌（STEC）O26在奶牛场中的发生、持久性及其基因组特征，研究人员在英国一家奶牛场开展了为期一年的纵向试点研究。通过多重采样与全基因组测序（WGS）分析，发现STEC O26:H11 ST21在畜群中持续存在，并与全球人源分离株存在系统发育关联但无直接遗传联系。该研究揭示了STEC O26在农场环境中的低检出率但持续性风险，为理解其人畜共患传播及制定风险管理策略提供了关键见解。
在微生物引发的食源性疾病中，有一类被称为产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）的病原体格外引人警惕。它们不仅能引起腹泻，严重时还可导致溶血性尿毒综合征（Hemolytic Uremic Syndrome, HUS），危及生命。长期以来，血清型O157是公众熟知的“罪魁祸首”，然而，近年来非O157血清型的STEC感染病例在全球范围内显著增加，其中O26血清型尤为突出，已成为英格兰地区人类HUS的重要致病原。牛被认为是STEC O26的主要储存宿主，但关于该菌株在特定奶牛场中的具体流行情况、能否在畜群和环境内长期存留、其遗传特征如何，以及与导致人类疾病的菌株是否存在直接关联，这些关键问题的答案却依然模糊。这种认知缺口，阻碍了针对该人畜共患病原体的有效风险管理。为此，一支研究团队将目光投向英国的一家奶牛场，展开了一场为期一年的追踪调查，旨在从基因组层面深入洞察STEC O26的场内生态与进化谜题。相关研究成果已发表在微生物学专业期刊《Frontiers in Microbiology》上。
为了回答上述问题，研究者开展了一项纵向试点研究。他们在英国一家先前筛查出STEC O26的封闭式奶牛场，在一年内分四次（包括一次初筛和三次跟踪访问）采集了共250份样本，包括粪便（ pooled pats和个体粪便）、靴套拭子以及环境样本。所有E. coliO26分离株均通过实时PCR（rt-PCR）确认，并利用短读长全基因组测序（WGS）进行深入表征，包括血清型、序列分型（ST）、克隆复合体（CC）、系统发育、志贺毒素（stx）亚型分型、肠细胞脱落位点（LEE）致病岛及其它毒力基因分析。此外，研究还应用了贝叶斯逻辑回归模型评估STEC检出与各种预测因子（如地点、样本类型、访问次数）之间的关联。为了理解农场分离株在全球背景下的位置，研究者从公共数据库下载了O26 ST21和ST29的基因组，与本研究分离株一起进行了核心基因组单核苷酸多态性（SNP）系统发育分析。
3.1 所有农场访问中STEC和非STEC的发生情况
从250份样本中总共回收了23株E. coliO26分离株。其中，14株为携带stx1、stx2和eae基因的STEC O26，9株为非STEC O26。此外，还发现了2株非O26 STEC（O130:H53和O145:H12）。对其中20株O26的成功测序证实，它们全部为O26:H11，其中12株STEC属于ST21（携带stx1a和stx2a），8株非STEC属于ST29，两者均属于克隆复合体CC29。检出率呈现时间和环境波动。
3.2 访问次数对STEC检出的影响
STEC O26的检出率在不同访问次数间存在差异，第三次访问（Visit 3）的检出数量显著高于第四次访问（Visit 4）。贝叶斯模型也显示，在最后一次访问（Visit 4）中检测到STEC O26的比值比（Odds Ratio, OR）较低，尽管由于阳性事件数量少，估计存在较大不确定性。
3.3 样本混合与地点对STEC O26检出的影响
混合粪便样本的STEC O26检出比例（8.4%）高于个体粪便样本（3.3%），但无统计学显著性。贝叶斯逻辑回归模型表明，户外地点与STEC O26检出几率显著降低相关[OR = 0.286, 95% CI: 0.074–1.104, P(OR < 1) = 0.965]。一个值得注意的现象是，除了第二次访问，在站点S1的同一个牛舍所有访问中都检测到了STEC O26。
3.4 基因组序列分析
3.4.1 STEC和非STEC O26的基因组特征
核心基因组SNP系统发育树显示，农场分离株按序列型分为两个明显群体：ST21和ST29。ST21 STEC O26:H11均携带stx1a、stx2a和eae基因。SNP距离矩阵分析表明，这些STEC O26 ST21分离株在四次访问中持续存在，许多分离株呈克隆（≤ 10 SNPs）或非常密切相关关系。将农场ST21分离株与全球公共基因组比较发现，它们形成了一个与英国人源STEC O26感染株相邻但独立的亚簇，与最接近的人源分离株至少相差51个SNPs，表明无直接的流行病学或遗传联系。另一群体ST29非STEC O26:H11则缺乏志贺毒素基因，但携带紧密素基因eae。它们首次出现在第三次访问的幼畜中，并在第四次访问中再次出现，内部呈高度克隆性。与公共ST29基因组的比较显示，它们与英国的三株人源ST29 STEC O26:H11接近，但至少相差29个SNPs。
3.4.2 毒力基因表征
所有O26分离株均携带LEE相关基因，其中7株ST21和2株ST29分离株拥有完整的LEE致病岛。其余分离株缺失1到13个LEE基因，主要在LEE1和LEE2操纵子中。除stx外，所有O26:H11分离株均携带毒力基因hlyA、hlyE、ehxA以及多种粘附/定植基因（如eae、eaeH、tir等）。质粒指示基因katP和espP存在于所有ST21 STEC O26:H11中，但不存在于ST29分离株中。非LEE编码（Nle）效应蛋白基因（如nleB、nleC、nleE、nleH）在大多数ST21分离株中检测到，但nleD缺失。
本研究的主要结论与意义在讨论部分得到了充分阐述。尽管在这家英国奶牛场上STEC O26的检出率较低（5.6%），但该血清型在为期一年的研究期间被持续检测到，表明其能够在农场环境中持久存在。STEC O26:H11 ST21被发现是农场中的持久性克隆，从首次访问到末次访问均能检出，且菌株间呈克隆或紧密相关，揭示了其在畜群内部的延续性。值得注意的是，这些农场分离株虽然与英国的人源STEC O26临床分离株在系统发育树上聚集相近，但遗传分析表明它们与最近的人源分离株至少存在51个SNPs的差异，这意味着在本研究期间，没有发现直接的传播证据或遗传联系，但它们属于可能构成人畜共患风险的相同进化分支。
研究还观察到，非产毒性的O26:H11 ST29菌株在研究中后期出现并在幼畜中克隆性传播，这可能暗示了不同序列型菌株在农场内的引入与竞争动态。此外，在潮湿环境（如水槽、走道积水）中检出STEC O26，凸显了环境持久性在维持农场污染中的潜在作用。从风险评估角度看，本研究中发现的STEC O26:H11 ST21携带eae、stx1a和stx2a基因，这一组合被国际机构（FAO/WHO）归类为导致HUS的最高风险类别之一，尽管其直接人源关联未证实，但其在动物宿主体内的持续存在本身就是一个持续的公共卫生风险点，特别是考虑到STEC的低感染剂量特性。
这项试点研究的价值在于，它首次利用纵向基因组学方法，详细描绘了STEC O26在单个奶牛场尺度上的发生模式、种群动态和微观进化。结果强调，即使检出率不高，STEC O26在牛群及其环境中的持久性不容忽视，因为它构成了潜在的人畜共患病库。研究采用的结合现场采样、WGS和生物信息学分析的方法框架，为未来更大规模的监测和溯源研究提供了范本。尽管本研究受限于样本量、时间点和农场数量，其发现仍增强了我们对非O157 STEC、特别是O26在农场层面生态学的理解，为制定更具针对性的干预措施以减少从农场到餐桌的传播风险提供了重要的科学依据。最终，该研究警示，在非O157 STEC感染日益增多的背景下，持续监控动物宿主中的此类病原体及其基因组特征，对于保障公共卫生和食品安全至关重要。
