《European Journal of Plant Pathology》：Application of high-throughput sequencing to detect residual virus and viroid infections in South African nuclear grapevine material
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本刊推荐：针对葡萄认证体系仅检测7种病毒的局限，研究人员利用高通量测序（HTS）技术对南非97份葡萄核种材料进行病毒组筛查。研究发现仅21份完全无感染，GRSPaV等5种病毒及HSVd等4种类病毒广泛残留，证实GRSPaV及类病毒对热疗和茎尖培养具有顽固抗性。该研究为优化认证体系的检测技术提供了关键数据支撑。
在南非广袤的葡萄酒产区，葡萄藤蔓绵延不绝，构成了国家经济的重要支柱。然而，这些看似茁壮的藤蔓背后，潜藏着看不见的威胁——病毒与类病毒。葡萄（Vitis spp.）作为一种主要通过营养繁殖的作物，极易积累病原体，其中病毒尤为棘手。目前已报道有101种病毒和7种类病毒侵染葡萄，它们可能导致减产、品质下降，甚至缩短葡萄园的寿命。为了保障产业健康发展，南非建立了严格的葡萄改良协会（VIA）认证体系，通过热疗、茎尖培养等技术生产无病毒（VF）的“核种材料”，作为所有繁殖材料的源头。然而，现行的检测标准仅覆盖7种主要病毒（如GLRaV-1–3、GVA、GVB、GFLV和GFkV），对于其他潜在病原体的监控存在盲区。这种局限性使得核种材料中可能残留着未被发现的“漏网之鱼”，随着繁殖材料的扩散，最终威胁整个产业链的安全。正是在这样的背景下，一项旨在全面清查南非葡萄核种材料中残留病原体的研究应运而生。
为了解决传统检测方法覆盖面不足的问题，研究人员决定引入强大的“透视镜”——高通量测序（HTS）技术。这项技术无需预先知道病原体的基因序列信息，能够无偏倚地捕捉样本中所有的核酸信息，是发现新型或隐性感染的利器。研究选取了来自南非三家植物改良组织（PIO）的97份核种葡萄材料，这些材料本应经过病毒消除程序并在无媒介昆虫的条件下保存。研究人员采集了叶柄和枝条组织，提取总RNA后，利用Ion Torrent平台进行了深度测序。随后，通过从头组装、参考基因组比对、RT-PCR及Sanger测序验证相结合的策略，对样本中的病毒和类病毒进行了全面的鉴定和系统发育分析。相关研究成果发表在了《European Journal of Plant Pathology》上。
在研究方法上，研究团队首先采集了97份核种葡萄材料，分两个时间点（2月底和6月底）采集叶柄和枝条，提取总RNA并等量混合以满足测序质量要求。随后，利用Ion Torrent平台进行RNA测序，产生的原始数据经质控后，采用CLC Genomics Workbench进行生物信息学分析，包括基于不同参数（默认及优化参数）的从头组装，并将组装得到的重叠群（contigs）与本地及NCBI数据库进行BLAST比对以识别病毒和类病毒。同时，利用参考映射工具将测序读段（reads）映射到已知的病毒和类病毒参考基因组上进行验证。最终，所有通过测序鉴定的阳性结果均通过病毒/类病毒特异性RT-PCR和Sanger测序进行了严格的实验确认。
结果
测序数据显示，平均每个样本获得约4337万条原始读段。令人担忧的是，在97份被视为“洁净源头”的核种材料中，仅有21份（21.6%）未检测到任何病毒或类病毒。
在病毒检测方面，共发现5种病毒，分布于8份材料中。其中，葡萄Rupestris茎痘伴随病毒（GRSPaV）最为普遍，存在于6份材料中；其余4种病毒——葡萄斑纹病毒（GFkV）、葡萄西拉病毒1型（GSyV-1）、葡萄卷叶伴随病毒4型（GLRaV-4）和葡萄Rupestris脉羽状病毒（GRVFV）——各在1份材料中检出。系统发育分析显示，GRSPaV分离株分属I型和IId型，后者最初即在南非被发现；GSyV-1与欧洲分离株聚为一支；GFkV属于I型；GLRaV-4则与已知分离株LR106亲缘关系最近。
类病毒的感染情况更为严峻，76份材料（78.4%）呈阳性，共检出4种已知类病毒和1种推定类病毒。啤酒花矮化类病毒（HSVd）检出率最高（63份，65.0%），其次为葡萄黄斑类病毒1型（GYSVd-1，52份，53.6%）、葡萄黄斑类病毒2型（GYSVd-2，17份，17.5%）和澳大利亚葡萄类病毒（AGVd，3份，3.0%）。此外，还在两份材料中发现了推定的葡萄锤头状类病毒样RNA（GHVd）。系统发育分析表明，HSVd分离株可分为三个群组；GYSVd-1呈现出复杂的四种类型混合感染，遗传多样性较高；而GYSVd-2和AGVd的遗传多样性则相对较低。柑橘裂皮类病毒（CEVd）、日本葡萄类病毒（JGVd）和葡萄潜伏类病毒（GLVd）在本次研究中未被检出。
讨论与结论
这项研究清晰地揭示了南非葡萄核种材料中残留病原体的真实图景。GRSPaV的顽固存在尤为引人注目，它不仅是检出率最高的病毒，且其IId型变体可能正是源自南非的核种材料。由于GRSPaV对热疗和茎尖培养具有较高的抗性，传统的消除手段难以将其彻底清除，使其成为核种材料中的一个持续隐患。类病毒的高检出率更是敲响了警钟，特别是HSVd和GYSVd-1在半数以上的材料中普遍存在。这表明，现行依赖热疗和茎尖培养的消除方案对类病毒效果不佳。文献指出，低温（10°C或更低）处理结合茎尖培养，或体细胞胚胎发生技术，可能是更有效的类病毒消除途径。
研究的结论具有重要的实践指导意义。首先，它证实了HTS技术在认证体系中进行全面病原体筛查的巨大价值，能够发现传统方法无法检出的病毒和类病毒。其次，研究结果直接指出了当前南非葡萄认证方案的短板：检测靶标过少，且对GRSPaV和部分类病毒的消除效率低下。因此，建议在未来的认证流程中，将HTS纳入常规检测项目，并针对顽固病原体（如GRSPaV、HSVd等）开发和采用更高效的消除技术（如低温疗法或体细胞胚胎发生）。只有这样，才能确保流向产业的每一株葡萄苗都真正“纯净”，从根本上保障南非葡萄产业的长期健康与竞争力。这项研究不仅为南非，也为全球的葡萄病毒病害防控和认证体系升级提供了宝贵的科学依据。
