用于原天然IgG Fab片段位点选择性荧光团偶联的化学酶法

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Chemoenzymatic method for site-selective fluorophore conjugation of a native IgG Fab fragment

抗体靶向偶联技术研究中，基于EzMTG-pG酶系统和新型DBCO-PEG4-LLQG底物，实现了Fab片段Lys65位点的选择性化学修饰（92%修饰率），并通过点击化学与荧光探针偶联保留细胞特异性结合能力。

　　

Eva Agustriana|Koki Murozono|Riko Nishioka|Yoshirou Kawaguchi|Michio Kimura|Noriho Kamiya

九州大学工学研究生院应用化学系，日本福冈市西区Motooka 744，邮编819-0395

抗体衍生的生物偶联物已成为诊断和治疗应用中的实用生物分子。一个关键挑战是实现位点选择性偶联，以保持标记生物分子的天然功能。针对天然氨基酸残基的方法可以扩大生物偶联物的应用范围；然而，大多数现有方法依赖于基因工程抗体来确保位点特异性标记。在本报告中，我们研究了一种化学酶法策略，使用EzMTG-pG融合蛋白（由微生物转谷氨酰胺酶变体和蛋白质G组成）来修饰来自曲妥珠单抗的天然Fab片段。为了减轻广泛使用的二苯并环辛炔（DBCO）基团的疏水性，我们设计了一种新的含DBCO的谷氨酰胺供体肽（DBCO-PEG4-LLQG）。这种底物肽能够在4小时内通过EzMTG-pG催化实现Lys65的选择性偶联，修饰率为92%。随后，Fab-DBCO偶联物与含有叠氮基的荧光小分子探针之间的点击反应生成了Fab-荧光团偶联物，该偶联物仍能特异性结合到目标细胞系上。这些结果表明，利用EzMTG-pG催化结合点击反应的化学酶途径为生成基于Fab的生物偶联物提供了一种多功能方法，这些偶联物在诊断和治疗领域具有潜在应用价值。

部分摘录

材料

人IgG1曲妥珠单抗（Herceptin）针对人类表皮生长因子受体2（HER2），购自F. Hoffmann-La Roche（瑞士巴塞尔）。木瓜蛋白酶购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。谷氨酰胺底物DBCO-YPLQMRG-NH₂和DBCO-PEG4-LLQG由Sigma–Aldrich Co. LLC（美国密苏里州圣路易斯）定制合成。FAM-PEG3-叠氮基化合物购自东京化学工业有限公司（日本东京）。Miller溶源菌肉汤（LB）

利用DBCO修饰的谷氨酰胺供体底物对Fab进行酶促偶联

我们使用最近开发的EzMTG-pG(Fab)催化剂（15,16）展示了通过点击反应将含有叠氮基的小分子引入Fab的化学酶方法（图1A）。这种方法能够实现位点特异性的引入，即将DBCO引入Fab。首先，我们通过替换先前报道的谷氨酰胺供体底物TAMRA-YPLQMRG-NH₂中的染料部分，设计了DBCO-YPLQMRG-NH₂（图1B），该底物用于Lys65的选择性标记

CRediT作者贡献声明

Eva Agustriana：撰写初稿、验证、实验研究、数据分析。Koki Murozono：实验研究、数据分析。Riko Nishioka：实验研究、数据分析。Yoshirou Kawaguchi：实验研究、数据分析。Michio Kimura：验证、方法学研究。Noriho Kamiya：撰写、审稿与编辑、验证、监督、方法学研究、概念构思。

致谢

本研究得到了AMED（项目编号：JP21ae0121004）和JSPS KAKENHI（项目编号：JP23H00247，资助对象：N. K.）的支持。作者感谢Edanz对本手稿草稿的编辑工作。