《npj Vaccines》：Noncanonical amino acids enable plug and play vaccine platform in the ALiCE cell free system
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本研究针对传统无细胞蛋白质合成(CFPS)系统在复杂蛋白生产与翻译后修饰方面的局限，利用高效的烟草BY-2无细胞系统(ALiCE?)，实现了非经典氨基酸(ncAA)在复杂蛋白中的高效、可扩展性引入。研究人员通过点击化学将流感血凝素受体结合域(RBD)与乙型肝炎核心病毒样颗粒(HBc VLP)偶联，成功构建了具有血凝活性并能保护小鼠免受流感攻击的VLP-RBD偶联疫苗。该工作为疫苗研发提供了一个新颖的、可定制的“即插即用”平台，拓展了BYL系统在疫苗候选物生产中的应用潜力。
疫苗研发领域始终在追求更安全、更有效且能快速应对病原体变异的平台技术。传统疫苗，尤其是针对流感等快速变异病毒的策略，常常面临免疫原性不足或生产周期长的挑战。与此同时，蛋白质工程中的一项利器——非经典氨基酸(ncAA)技术，因其能为蛋白质引入新颖的化学功能，从而方便后续的精准修饰与偶联，在疫苗设计中展现出巨大潜力。理想的疫苗平台应当像组装乐高积木一样，能够将不同的病原体抗原模块化地、快速地展示在安全的载体上，以激发强大的保护性免疫。然而，将ncAA技术应用于复杂疫苗抗原的生产并非易事，关键瓶颈在于高效、可规模化且能处理复杂蛋白的“蛋白质合成车间”。常规的基于细菌的无细胞蛋白质合成(CFPS)系统虽然在ncAA引入上有所应用，但其“车间”环境（原核背景）难以胜任许多哺乳动物来源的、需要复杂折叠与修饰（如糖基化）的疫苗抗原的生产。而传统的真核CFPS系统，要么产量低下，要么难以扩大生产规模，这让许多美好的设想停留在实验室阶段。那么，能否找到一个既能高产合成复杂蛋白，又能高效、大规模引入ncAA的“超级车间”呢？
为了破解这一难题，研究人员将目光投向了一个高效的商业化真核无细胞系统——基于烟草BY-2细胞裂解物的CFPS系统，其商业名称为ALiCE?。本研究的目标，就是验证并利用这个“超级车间”，建立一个新颖的、基于ncAA与点击化学的模块化“即插即用”型疫苗平台。
研究人员开展此项研究主要运用了以下几个关键技术方法：1. 利用高效的真核无细胞蛋白质合成系统（烟草BY-2裂解物系统，BYL/ALiCE?）进行蛋白质生产；2. 通过遗传密码扩展技术，在目标蛋白的特定位点引入非经典氨基酸（文中示例为对乙酰基苯丙氨酸，pAcF）；3. 运用菌株-正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶对实现ncAA的特异性掺入；4. 利用点击化学反应（具体为肟连接反应）将携带ncAA的抗原蛋白与经过修饰的病毒样颗粒载体进行特异性生物偶联；5. 使用动物模型（小鼠）进行疫苗免疫原性与保护效力的评价。
高效、可扩展的ncAA掺入
研究人员首先在BYL系统中测试了ncAA的掺入效率。他们成功地在模型蛋白（绿色荧光蛋白，GFP）和更具实际意义的疫苗抗原——流感病毒血凝素(HA)的受体结合域(RBD)中，特异地引入了非经典氨基酸对乙酰基苯丙氨酸(pAcF)。结果表明，该系统表现优异，ncAA掺入的蛋白产量最高可达2 mg/ml，并且线性放大至10 ml体积时仍能稳定生产，证明了其良好的可扩展性，为后续应用奠定了基础。
模块化疫苗的构建与生物物理表征
利用BYL系统高效生产的、携带pAcF的流感HA RBD蛋白，研究人员通过点击化学（肟连接反应），将其与预先制备好的、表面带有氨基氧基团的乙型肝炎核心蛋白病毒样颗粒(HBc VLP)进行共价偶联，从而构建出VLP-RBD偶联疫苗。对偶联产物的分析显示，RBD成功地、高密度地展示在了VLP的表面，形成了规则的纳米颗粒结构。
体外功能验证：血凝活性的恢复
一个关键的体外功能实验证实了该平台的有效性。单独的RBD蛋白或未经偶联的混合组分均不能使红细胞发生凝集，而构建出的VLP-RBD偶联物则表现出了明显的血凝活性。这有力地说明，通过该平台将RBD模块化地展示在VLP载体上，能够使其形成正确的空间构象，并发挥其天然的生物学功能——识别红细胞表面的唾液酸受体，这是诱导有效免疫反应的重要前提。
体内免疫原性与保护效力评估
最后，研究在动物模型中验证了该疫苗平台的保护效果。用VLP-RBD偶联疫苗免疫小鼠后，能够诱导产生高滴度的、特异针对流感HA的抗体。在后续的致死剂量流感病毒攻毒实验中，与对照组相比，免疫了VLP-RBD疫苗的小鼠得到了显著的保护，其体重下降幅度更小，恢复更快。这直接证明了通过此平台构建的疫苗能够在活体内激发有效的免疫保护，抵御病毒攻击。
本研究得出结论，首次在高效、可规模化的真核无细胞系统ALiCE?(BYL)中，成功实现了复杂蛋白质中非经典氨基酸(ncAA)的高效、位点特异性引入，产量高且线性扩展性良好。利用这一技术，研究人员创建了一个模块化的“即插即用”疫苗平台：将携带ncAA的流感病毒血凝素受体结合域(RBD)抗原，通过点击化学精准偶联到乙型肝炎核心病毒样颗粒(HBc VLP)载体上，所获VLP-RBD偶联物在体外恢复了血凝活性，并在体内能有效保护小鼠免受流感病毒感染。该研究不仅拓展了BYL无细胞系统在生产疫苗候选蛋白及其他感兴趣蛋白方面的能力，更重要的是，它提供了一种快速、通用且可定制的疫苗构建新策略。通过简单地更换插入不同病原体的、携带ncAA的抗原模块，即可快速构建出针对不同疾病的VLP疫苗，这对于应对新发、突发传染病的威胁具有重要的战略意义。这项工作为下一代疫苗研发提供了强有力的技术工具和崭新的思路。
