综述：肌纤维启发的纳米纤维微束可诱导人脂肪源性干细胞向肌源性分化

《Bioactive Materials》：Muscle-fiber-inspired nanofibrillar microbundles induce myogenic differentiation in human adipose-derived stem cells

　　

骨骼肌功能依赖于单向排列的肌纤维，其排列整齐的细胞外基质（ECM）提供了调控肌源性行为的有指导性的形貌信号。本文介绍了一种熔融电纤化策略，即先对聚（ε-己内酯）/聚（醋酸乙烯酯）共混物进行熔融电写（MEW），再选择性去除聚醋酸乙烯酯，以制造呈现类胶原纳米形貌的高度排列的纳米纤维微束支架。研究人员首先与二维组织培养聚苯乙烯对照相比，利用原代人骨骼肌细胞（HSkMCs）验证了其生物相容性和排列引导能力。随后，研究人员评估了人脂肪源性干细胞（hASCs）在纳米纤维支架上相对于传统MEW打印的微纤维和二维对照组的肌源性反应。纳米纤维在超过35天内支持细胞持续存活，并促进了显著的细胞排列、对齐的I型胶原沉积以及增强的肌源性分化。在第28-35天，支架上的hASCs形成了肌球蛋白（myosin）阳性的、多核的肌管样结构，并通过qPCR检测显示肌细胞生成素（MYOG）和肌形成因子6（MYF6）表达增加。批量RNA测序（第21天）进一步显示，纳米纤维诱导了一种独特的转录状态，富含肌肉发育/分化和收缩相关程序，并伴随着机械敏感信号传导和粘附-细胞骨架重塑通路（如PI3K-Akt、MAPK、Wnt、Hippo和TGF-β）的激活。肌联蛋白（Titin）免疫染色揭示了早期肌节组装，表明其向成熟发展。总的来说，纳米纤维支架建立了一个可编程的、模拟肌肉的纤维生态位，增强了hASCs的形貌驱动的肌生成，并支持长期培养，为体外肌肉组织工程提供了一个多功能平台。

论文主体部分内容总结

1. 引言

骨骼肌是人体最丰富的组织之一，在实现身体运动、维持姿势和驱动运动中起着关键作用。然而，由于其广泛参与身体活动，骨骼肌容易因劳损、创伤、挫伤、运动或手术干预而受伤，这可能破坏肌肉功能并导致组织纤维化和慢性残疾。尽管受损肌肉通过激活、增殖和分化肌肉驻留干细胞具有内在的再生能力，但在严重损伤、衰老和慢性炎症期间，它无法恢复体积性肌肉损失（VML）。当前的黄金标准治疗方案涉及将自体肌肉瓣移植到受损肌肉组织中。然而，供体部位的可用性有限、供体组织发病率和功能丧失限制了肌肉瓣在临床应用中的使用。这些限制促使了能够重建天然肌肉关键结构线索以引导有序再生的生物材料平台的发展。骨骼肌是由称为肌纤维的密集排列且高度单向排列的微结构组成的高度组织化组织。骨骼肌的正常功能在很大程度上依赖于分层排列的肌纤维，肌纤维产生收缩力。肌纤维除了运动功能外，还支持驻留的肌肉干细胞（称为卫星细胞），并作为引导它们形成细长、多核肌管的模板。在组织工程和生物制造中，由于鼠成肌细胞（C2C12）与原代骨骼肌细胞相比的稳健性和易于操作性，常转而依赖它们。另一个有前景的途径是多能间充质干细胞（MSCs），其具有向成骨、成软骨、成脂和成肌谱系分化的潜力。这些细胞来源于骨髓、脂肪组织和骨骼肌等多个部位，为组织再生开辟了新的可能性。特别是来自脂肪组织的MSCs，也称为脂肪源性干细胞（ASCs），易于从废弃的脂肪组织中获取，且细胞数量不受限制，提供了比其他来源更易获取和丰富的细胞来源。ASCs移植通过分泌免疫调节细胞因子促进了大鼠损伤模型中的肛门括约肌修复，并且也有助于在免疫健全的mdx小鼠中形成新的肌纤维。此外，体外实验揭示了ASCs与C2C12细胞融合形成肌管的能力。然而，ASCs的稳健和高效肌源性诱导仍然具有挑战性，通常需要广泛的生化和/或生物物理刺激。因此，ASCs提供了一个严格且具有临床相关性的细胞来源，以测试特定的支架形貌是否能够偏斜谱系定型。因此，能够精确复制肌纤维微纳结构、控制三维（3D）细胞分布和排列的生物材料支架，在推进肌肉再生策略和解决关键组织损失情况方面具有巨大潜力。传统上，成肌细胞的细胞排列和各向异性排列是通过定义的微结构沟槽或通过微图案化的各向异性排列的细胞粘附蛋白在二维（2D）基底上实现的。这些生物材料促进了细胞伸长和排列的肌管形成。或者，静电纺纳米纤维在纳米尺度上非常类似于细胞外基质（ECM）蛋白的结构排列，并且可以用生物活性信号进行功能化。先前的研究表明，纳米纤维的排列对粘附、伸长和肌源性分化有显著影响。最近的报告表明，排列的纳米纤维支架刺激了人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞的伸长，这些细胞进一步融合形成肌管。尽管体外结果有前景，但静电纺纳米纤维支架是紧密堆积的纳米纤维片，孔隙率低，限制了细胞浸润，主要提供用于细胞生长和分化的2D表面，而排列成微束的肌纤维允许细胞在3D微环境中生长。相反，熔融电写（MEW）能够将纤维精确、可编程地沉积到可重现的架构中，但其纤维通常在微米范围内，限制了直接再现ECM相关的纳米形貌。因此，一个关键未满足的需求是一种将类ECM纳米形貌与MEW的几何可控性和可重复性相结合的制造策略。在天然骨骼肌组织中，卫星细胞被高度有序的胶原纤维包围，其纳米形貌线索极大地影响卫星细胞向成肌细胞的生长和分化。此外，据报道，损伤后残留的ECM纤维可引导卫星细胞排列、增殖和肌管形成，以确保肌肉再生。因此，由排列在微束中的纳米纤维组成的生物材料支架可以模拟肌肉组织的3D微结构，并且其微束的纳米形貌方面可以调节干细胞中的肌源性诱导。本研究评估了排列的纳米纤维微束（nFMBs）的制造，并使用扫描电子显微镜（SEM）对其进行了表征，并进行了拉曼光谱和X射线衍射（XRD）分析。最后，通过免疫荧光染色和qPCR分析，研究了nFMBs对HSkMCs和hASCs形态和肌源性诱导的影响。

2. 材料与方法

2.1. 纳米纤维微束的熔融电纤化

制备了三种不同比例（70/30、75/25、80/20）的聚（醋酸乙烯酯）（PVAc）和聚（ε-己内酯）（PCL）共混物。使用定制的MEW设备打印支架。打印参数包括：注射器预热至175°C，喷嘴160°C，针尖到收集器距离约3mm，施加电压3kV，压力1bar，收集器速度1500mm/min。打印出间距为0.25mm的排列微纤维（1cm×1cm）支架。用加热至120°C的金属冲头在边缘压印打印的支架以防止去纤维化。通过用70%乙醇洗涤支架两次各30分钟，接着第三次洗涤1小时，选择性溶解PVAc，以暴露PCL纳米纤维微束，形成nFMBs。然后在进一步表征前，用蒸馏水洗涤三次，每次5分钟，以去除乙醇。

2.2. 支架表征

使用体视显微镜对支架进行宏观成像，初步确认nFMBs中纳米纤维微束的形成，并与PCL微纤维支架（mFiBs）进行结构比较。随后，在支架上溅射涂覆8nm铂层后，通过扫描电子显微镜（SEM）获取纳米纤维微束的高分辨率图像。使用ImageJ软件进行图像分析，测定纤维直径。通过拉曼光谱分析验证洗涤前后PVAc的缺失。使用配备780nm激光的拉曼显微镜，在10倍放大倍数下进行测量。通过热重分析（TGA）评估支架的热降解行为。使用X射线衍射（XRD）记录衍射图案。通过拉伸测试评估支架的机械性能。

2.3. 细胞培养

按照制造商的建议培养人骨骼肌细胞（HSkMCs）和人脂肪源性干细胞（hASCs）。两种细胞类型均使用至第7代。HSkMC实验作为支架生物相容性/排列的初步基准验证，而hASC实验是主要研究重点，进行了更多重复。对于细胞实验，将细胞培养在支架（nFMBs或mFiBs）上或标准的组织培养处理的聚苯乙烯板（TCP）上作为2D对照。支架在70%乙醇中灭菌，紫外线照射30分钟，并用不含钙和镁的DPBS洗涤五次。在接种前，将支架在相应的完全生长培养基中预湿至少30分钟。然后将支架转移到超低附着（ULA）包被的6孔板中，并用预灭菌的金属环固定以防止漂浮。对于2D对照，将细胞直接接种到标准的组织培养处理的6孔板中。当细胞融合度达到约90%时，用胰蛋白酶-EDTA消化并离心收集。随后，每个支架（以及2D对照的每个孔）接种5×10⁵个细胞。接种后，在完全生长培养基中维持构建体5天，以允许附着并实现支架覆盖，然后进行下游分析。

2.4. 活/死染色

在第7、21和35天使用活/死染色试剂盒评估支架上细胞的活力。用Calcein AM和ethidium-homodimer工作液处理细胞30分钟，然后在标准培养条件下，使用共聚焦显微镜捕获图像。

2.5. 免疫荧光染色

在第7天进行F-肌动蛋白染色以分析细胞形态和排列。收集的样本用PBS洗涤，并在4%多聚甲醛中于4°C固定过夜。然后用PBS洗涤三次，在封闭缓冲液中室温孵育1小时。然后应用Phalloidin-iFluor 555工作液在室温避光下孵育1小时。随后用PBS洗涤五次，每次5分钟。最后，用DAPI封片，并使用共聚焦显微镜分析。使用ImageJ评估细胞排列。

2.6. 黏着斑和ECM染色

使用桩蛋白（paxillin）和I型胶原抗体染色进行黏着斑和ECM染色。样本固定和封闭后，用抗桩蛋白和抗I型胶原工作液在4°C孵育过夜。然后用Alexa Fluor 488标记的二抗在室温避光下孵育2小时。洗涤后用DAPI封片，并使用共聚焦显微镜拍摄图像。

2.7. 支架上细胞的SEM成像

样本在4%多聚甲醛和6%戊二醛中各固定15分钟。然后用梯度乙醇系列脱水至100%，并用六甲基二硅胺烷干燥。在支架上溅射涂覆4nm铂层。使用场发射电子显微镜获取SEM图像。根据制造商说明进行聚焦离子束（FIB）切割，并拍摄SEM显微照片以分析细胞浸润。

2.8. 肌源性分化

细胞接种后，支架在生长培养基中维持5天以实现完全细胞覆盖。然后将培养基更换为分化培养基，并将此时间点定义为第1天。对于HSkMCs，使用骨骼肌分化培养基诱导肌源性分化。HSkMC对照条件维持在相应的HSkMC生长培养基中。对于hASCs，肌源性诱导培养基由高糖DMEM补充2%马血清、50ng/mL胰岛素样生长因子（IGF）、5μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸和1%青霉素-链霉素（P/S）组成。实验阶段相应的hASC对照组培养在高糖DMEM补充10%胎牛血清（FCS）和1% P/S中。对于肌源性标志物染色，样本使用抗肌球蛋白、抗肌细胞生成素或抗肌联蛋白抗体按照黏着斑和ECM染色所述相同程序进行免疫染色。

2.9. 肌源性基因表达

收集HSkMCs在分化培养基条件下培养第1、7和14天的样本，以及hASCs在第7、14、21、28和35天的样本。样本在Trizol中匀浆并储存于-80°C。提取RNA，测量浓度，并合成cDNA。通过qPCR分析肌源性标志物（MYOG和MYF6）的表达，以hEF1α作为内参基因。通过2^-ΔΔCt法计算相对表达量，并以2D对照在生长培养基中的表达进行标准化。

全转录组测序（RNA-Seq）分析：在第21天对hASCs进行转录组测序分析。使用RNeasy Plus Mini Kit提取总RNA。质量评估后，使用poly-T oligo附着磁珠富集mRNA，并使用TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Kit构建链特异性文库。在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序（150bp）。使用FastQC评估原始测序数据质量，使用Trimmomatic去除接头序列和poly-A序列。使用HISAT2将清理后的读段比对到人参考基因组（GRCh38）。使用StringTie进行转录本组装和定量，基因表达水平计算为每百万映射读段中每千碱基转录本的片段数（FPKM）。使用DESeq2识别差异表达基因，阈值设定为至少1.5倍的倍数变化和p值小于0.05。使用R进行主成分分析、维恩图、热图和火山图的生成。使用过度富集分析进行功能富集分析，并使用clusterProfiler包进行KEGG通路富集分析。

2.10. 统计分析

定量数据以平均值±标准差表示。使用Student's t检验、单因素方差分析（单因素比较）和双因素方差分析（双因素比较）后进行Bonferroni事后检验评估统计显著性，视情况而定。p<0.05的显著性水平被认为具有统计学意义。

3. 结果与讨论

3.1. 用于制造排列纳米纤维微束的熔融电纤化

为制造肌纤维启发的纳米纤维微束，采用了熔融电纤化（MEF）方法。首先，通过熔融电写（MEW）制备了PCL与高份额PVAc共混的排列微纤维（mFiBs）。之后，用70%乙醇洗涤mFiBs以溶解PVAc，形成高度有序的纳米纤维微束（nFMBs）。筛选了不同比例的PCL和PVAc共混物，包括30% PCL+70% PVAc、25% PCL+75% PVAc、20% PCL+80% PVAc。结果证实，只有30% PCL+70% PVAc共混的mFiBs形成了高度有序且稳定的排列纳米纤维微束。拉曼光谱分析证实了所有共混物洗涤前存在PVAc的特征峰，而洗涤后所有洗涤样品中均无PVAc相关峰，表明三步洗涤过程有效去除了共混物中残留的PVAc。相反，在PCL-mFiBs和三次洗涤后的纳米纤维微束中检测到PCL的特征峰。对30% PCL+70% PVAc共混mFiBs洗涤前后各阶段的SEM图像显示，初始阶段观察到排列的微纤维。第一次洗涤后，PVAc溶解，形成表面膜。随后的洗涤揭示了纳米纤维微束，但仍有PVAc残留。第三次洗涤显示出清晰的纳米纤维微束，表明PVAc完全去除。X射线衍射（XRD）分析显示，洗涤前，共混mFiBs中存在PVAc的特征宽峰（14.5°和22.4°）与PCL的尖锐峰（21.4°和23.9°）共存。第一次洗涤后，PVAc峰强度显著降低，第三次洗涤后几乎完全消失。同时，观察到代表PCL的尖锐峰出现。在洗涤样品中，23.8°处的特征PCL峰相比PCL-mFiBs增强，表明洗涤后支架中PCL的结晶度或分子有序性可能增加。热重分析（TGA）显示，所有聚合物和共混物在高达250°C时均无质量损失，确认适合MEW加工。纯PVAc在300°C开始发生脱乙酰化降解，随后在415°C发生结构骨架降解。PCL颗粒在270°C开始逐渐降解。PCL-PVAc共混mFiBs的热降解也分为两步（300°C和354°C），介于PVAc和PCL的降解模式之间。值得注意的是，观察到随着每次洗涤步骤，支架的热稳定性增强；PCL-mFiBs显示出比纯PCL颗粒稍好的耐热性，而这种耐热性在纳米纤维微束支架中进一步增强。图像分析显示，PCL-mFiBs和nFMBs均表现出单向排列。然而，nFMBs中纳米纤维的分布比PCL-mFiBs稍宽，这归因于微束内纳米纤维的包装稍松。nFMBs中纤维的直径测量为0.347±0.11μm（约350nm），而PCL-mFiBs记录的直径为67±11.8μm。拉伸测试显示所有支架行为相似，PCL-mFiB显示出更高的极限抗拉强度。PCL-mFiB以及未洗涤和洗涤的nFMBs的杨氏模量分别为859.63MPa、876.85MPa和643.42MPa。MEF策略结合了类胶原纳米形貌与由G代码定义的、有序的、确定性的布局，从而将纳米级线索与可编程结构相结合。

3.2. 原代人骨骼肌细胞在纳米纤维微束上的肌源性诱导

为评估生物相容性和nFMBs对肌源性诱导的影响，在nFMB支架上培养人骨骼肌细胞（HSkMCs），并将其反应与接种在标准组织培养板（TCP）上的2D对照组进行比较。在两组中，细胞在生长培养基中维持五天以允许附着并实现支架上的完全细胞覆盖。随后，应用肌源性诱导培养基，并通过免疫荧光染色和定量PCR（qPCR）评估肌源性分化。免疫荧光分析表明，nFMBs促进了HSkMCs的粘附，纤维状形貌显著影响细胞排列。值得注意的是，没有对nFMBs表面应用任何额外处理来增强细胞粘附。nFMBs中纳米纤维的存在显著增加了表面粗糙度，从而促进了增强的细胞粘附。此外，在排列的nFMBs上，HSkMCs在第7天开始形成多核肌管，到第14天肌管长度和宽度均明显增加。qPCR分析显示，与2D对照相比，nFMBs组中MYOG和MYF6的表达在所有研究的时间间隔内均显著更高。这些发现强调了纳米纤维微束形貌在促进细胞排列和粘附以及增强与肌肉分化和成熟相关的基因表达方面的影响。nFMBs无需添加信号即可支持细胞粘附，引导细胞形态，并最终导致细胞的肌源性分化。在本研究的主要部分，重点转向hASCs，以提供对支架更严格的测试，因为hASCs由于其有限的生长和分化潜力，是肌源性诱导更具挑战性的模型。

4. 通过纳米纤维微束诱导人脂肪源性干细胞肌源性分化

随后，在nFMBs上建立了hASCs培养，并将其对hASCs的影响与PCL-mFiBs在35天培养期内的效果进行了比较。评估了细胞的活力、排列、ECM分泌和肌源性诱导。在生长和分化培养基中均研究了肌源性诱导。活/死细胞染色揭示了细胞在这些基底上粘附和活力的不同行为。到第7天，hASCs完全覆盖了nFMBs的表面，表明细胞粘附良好，且在培养期间细胞密度没有显著变化。此外，在整个培养时间内，在nFMBs上生长的hASCs中观察到的细胞死亡信号极少。相比之下，在PCL-mFiBs上，细胞在第7天粘附在纤维周围，但未完全覆盖表面。这些稀疏粘附的细胞表现出相当数量的细胞死亡信号。然而，随着培养时间延长（第21天和第35天），细胞在PCL-mFiBs上的粘附有所改善，但仍存在死细胞信号。然后检查了在支架上培养的hASCs的排列和形态。肌动蛋白染色提供了对基底上细胞排列的见解，揭示了hASCs在支架上高度有序的排列，类似于肌肉纤维中观察到的自然排列。有趣的是，在PCL-mFiBs上培养的细胞倾向于形成聚集体，可能受较大直径纤维的影响，导致与在nFMBs上观察到的更有组织的排列相比，细胞排列受损。定量图像分析进一步支持了这些观察，表明与在PCL-mFiBs上观察到的更广泛的排列分布相比，nFMBs上的细胞排列程度更高。此外，检查显示nFMBs将核圆度显著降低至0.5，而PCL-mFiBs上的细胞显示出更高的圆度值0.8。这种核圆度的降低表明，与在PCL-mFiBs上观察到的组织性较差、更圆润的细胞形态相比，纳米纤维微束基底促进了更细长和排列的细胞形态。然后检查了hASCs的黏着斑与基底内纤维的关系。桩蛋白染色表明，黏着斑信号在nFMBs内的纳米纤维旁边显著分布。相反，PCL-mFiBs上的桩蛋白信号强度相对较低，表明两种基底之间细胞-材料相互作用的程度存在差异。这种桩蛋白信号的差异表明，粘附在nFMBs内纳米纤维上的细胞可以主动调节其形态和细胞反应。进一步的SEM成像提供了更多见解。在PCL-mFiBs上，细胞似乎包裹或缠绕纤维，而在nFMBs内，细胞沿纤维高度排列的方向明显。这一观察强化了这些基底上不同细胞行为的概念，强调了纳米纤维微束结构在引导细胞排列和形态方面的影响。除了细胞形态和支架相互作用外，还确认了细胞浸润到nFMBs支架中。z-stack共聚焦图像，特别是来自DAPI染色的图像，显示了多个层面的细胞，证明它们存在于支架内。然而，也观察到在PCL-mFiBs中，单层细胞覆盖了纤维外围。为了进一步验证这些结果，进行了聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM），确认了细胞浸润到nFMBs支架中，强调了这些支架在制造3D体外组织和帮助恢复体积性肌肉损失方面的潜力。此外，通过免疫染色评估了I型胶原的分泌。结果揭示了两种基底之间I型胶原沉积模式的显著差异。在nFMBs的纳米纤维上观察到显著排列的胶原沉积，与在PCL-mFiBs上观察到的组织性较差的分布形成对比。这些发现强调了nFMBs不仅支持细胞粘附，还能以排列的方式刺激I型胶原（骨骼肌ECM的关键成分）的分泌。这突显了nFMBs通过促进特定的ECM沉积和细胞-材料相互作用，在促进适合组织工程应用的细胞环境方面的潜力。最后，评估了在nFMBs上培养的hASCs与PCL-mFiBs相比的肌源性诱导。通过肌细胞生成素（MYOG）染色评估肌源性分化，在nFMBs上培养的细胞显示出比在PCL-mFiBs上明显更高的MYOG阳性细胞群体。随着培养时间从第21天延长到第35天，观察到MYOG阳性细胞明显增加。相反，PCL-mFiBs上的细胞显示出稀疏的MYOG阳性信号，到第35天仅观察到少数MYOG阳性细胞。在不同条件下hASCs中肌源性标志物MYOG和MYF6表达的评估提供了关于支架类型影响的见解。qPCR分析显示，在生长和肌源性培养基条件下，nFMBs支架上MYOG和MYF6的表达随时间持续增加。值得注意的是，在分化培养基条件下，nFMBs上观察到肌源性标志物表达的协同上升，强调了支架进一步促进肌源性分化过程的能力。类似地，与2D对照和生长培养基中的nFMBs相比，PCL-mFiBs在分化培养基中显示出肌源性标志物的显著表达。然而，与分化条件下的nFMBs相比，PCL-mFiBs上的表达相对较低。总体而言，nFMBs在所有组别和时间间隔内始终显示出肌源性标志物表达的显著增加。特别有趣的是，观察到即使在生长培养基条件下，与所有条件下的2D对照以及生长培养基中的PCL-mFiBs相比，nFMBs也显示出显