《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Subtractive Proteomics and Immunoinformatics-Guided Design of a Multi-Epitope Vaccine Against Aspergillus fumigatus
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针对侵袭性曲霉病缺乏有效疫苗且抗真菌药物耐药率上升的难题，研究者利用免疫信息学方法，以烟曲霉高度保守的1,3-β-葡聚糖基转移酶为靶点，设计了WLaf1/WLaf2多表位疫苗。结果显示候选疫苗抗原性强、非过敏，可与TLR1–TLR2异二聚体/TLR4稳定互作，诱导强效体液/细胞免疫应答，为真菌疫苗研发提供新思路。
侵袭性曲霉病（IA）是全球范围内日益严重的公共卫生威胁，尤其对免疫功能低下群体而言更是致命隐患。作为最主要的病原体，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）每年导致超过30万例感染，死亡率高达50%。更严峻的是，现有一线三唑类抗真菌药面临日益严重的耐药问题——部分医疗机构的耐药率已达30%，而全球至今尚无获批的烟曲霉疫苗。面对诊断困难、治疗昂贵且副作用显著的多重挑战，开发预防性疫苗已成为迫在眉睫的突破口。
在这项发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》的研究中，科研团队独辟蹊径，将目光投向真菌生存的“阿喀琉斯之踵”——细胞壁重塑的关键酶。他们利用前沿的减量蛋白质组学（subtractive proteomics）与免疫信息学（immunoinformatics）策略，成功设计出两款靶向烟曲霉的多表位疫苗WLaf1和WLaf2，并通过系统的计算模拟验证了其引发强效免疫应答的潜力。这一成果不仅为对抗烟曲霉感染提供了新颖的候选方案，也为真菌疫苗研发开辟了从靶点筛选到构效验证的全链条技术路径。
为完成疫苗设计与评估，研究者整合多项关键技术：① 基于NCBI数据库获取烟曲霉参考蛋白质组，通过Diamond比对排除人类同源蛋白，结合必需基因库（DEG）、毒力因子库（PHI-base/DFVF）筛选关键靶点；② 采用NetMHCpan/NetMHCIIpan预测T细胞表位，ABCpred/LBtope预测B细胞表位，经抗原性、毒性、过敏性及保守性分析过滤；③ 借助AlphaFold 3.0构建疫苗三维结构，经GalaxyRefine优化后通过PROCHECK/ERRAT/ProSA验证模型质量；④ 利用ZDOCK/HADDOCK进行疫苗与Toll样受体（TLR1–TLR2/TLR4）分子对接，结合GROMACS开展100 ns分子动力学模拟，分析复合物稳定性；⑤ 应用IEDB人口覆盖工具评估全球适用性，通过C-ImmSim模拟免疫应答；⑥ 运用JCAT优化大肠杆菌密码子，设计pET-28a(+)克隆载体。
靶点鉴定与表位筛选
从烟曲霉9630个蛋白中，通过多步过滤（排除人类同源蛋白、锁定必需/毒力相关膜蛋白），最终选定两种高度保守的1,3-β-葡聚糖基转移酶（GPI锚定细胞壁重塑酶）作为靶点。随后筛选出8个CTL表位（如STSGDYGAY）、5个HTL表位（如KAAVRDMKSYIKSKD）和10个B细胞表位，均满足高抗原性（VaxiJen评分>0.5）、无毒、非过敏、与人无交叉反应且保守度>95%的标准。
疫苗构建与理化性质
通过AAY/GPGPG/KK接头连接表位，并在两端添加TLR激动剂（WLaf1用RS09+HBD-3，WLaf2用RS09+Pam2Cys）及PADRE序列、6×His标签。理化分析显示：WLaf1（454 aa）抗原性评分1.3445，WLaf2（428 aa）1.4048，两者均非毒素/过敏原，无跨膜螺旋/信号肽，理论可溶（SOLpro概率>0.87）。
结构建模与质量验证
AlphaFold预测的三维模型经Ramachandran图检验（WLaf1/WLaf2核心区占比>95%）、ERRAT评分（91.59/99.62）及ProSA Z值（-4.15/-3.61）验证结构可靠。二级结构显示WLaf2含更多α螺旋（15个）及3个二硫桥，结构更紧密。
分子对接与动力学模拟
疫苗与先天免疫受体对接显示：WLaf1–TLR4复合物HADDOCK得分最高（-824.4），埋藏表面积达12305.1 ?2，形成6个盐桥+18个氢键；WLaf1–TLR1–TLR2复合物亦表现稳定。100 ns分子动力学（MD）模拟中，WLaf1–TLR复合物的RMSD（0.90–1.11 nm）、回旋半径（3.20–3.34 nm）波动更小，氢键数量（20–27个）更高，提示更优稳定性。MM-PBSA结合自由能计算进一步证实WLaf1–TLR4结合最强（ΔG=-277.11 kcal/mol）。
人群覆盖与免疫模拟
全球人群覆盖率达99.98%，东南亚（99.92%）、南亚（99.83%）等高发区域均获广泛覆盖。C-ImmSim免疫模拟预测：WLaf1诱导更强的抗体（IgG峰值>2×10?）、记忆B细胞增殖及T细胞（CTL/HTL）活化，伴随高水平IFN-γ/IL-2分泌，整体应答优于WLaf2及对照疫苗。
密码子优化与克隆设计
经JCAT优化后，WLaf1/WLaf2的密码子适应指数（CAI）均为1.0，GC含量约49%，适配大肠杆菌K12表达系统。BamHI/XhoI酶切位点引入pET-28a(+)载体，完成克隆设计。
本研究首次系统性鉴定了烟曲霉1,3-β-葡聚糖基转移酶作为疫苗靶点的潜力，并成功构建了WLaf1/WLaf2多表位疫苗。计算结果表明：候选疫苗具备高抗原性、安全性及结构稳定性，能与TLR1–TLR2/TLR4形成稳定复合物，激活广谱的体液与细胞免疫应答；其中WLaf1在结合稳定性与免疫预测中表现更优。尽管研究存在表位体内呈递不确定性等局限，但其为烟曲霉疫苗研发提供了从靶点发现到构效验证的全流程框架，对应对抗真菌耐药危机、保护免疫功能低下群体具有重要转化价值。
