《Journal of Chromatography A》：A chromatographic approach to avoid the matrix effect caused by sodium acetate clusters in the liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry analysis of free fatty acids in human plasma
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液相色谱-电喷雾电离质谱分析中钠离子与醋酸根形成的簇离子会干扰游离脂肪酸检测，采用反相/弱阴离子交换/弱阳离子交换三模色谱柱可有效分离钠离子与脂肪酸，降低基质效应，提升检测灵敏度和准确性。
福岛由纪|山本和宏|町田幸一|小谷彰|箱田英树
东京药科大学药学院分析化学实验室，日本东京八王子市堀之内1432-1，邮编192-0392
摘要
液相色谱与电喷雾离子化质谱联用（LC-ESI-MS）在药代动力学研究、临床诊断和治疗药物监测中广泛用于生物样品的分析。然而，样品中存在的共存物质引起的基质效应常常会降低分析的灵敏度和准确性。我们的研究表明，由人血浆中的钠离子和流动相中的醋酸根离子形成的钠醋酸根簇会干扰反相（RP）LC-ESI-MS分析中游离脂肪酸（FFAs）的检测。为了解决这个问题，我们使用了一种三模态柱（反相/弱阴离子交换/弱阳离子交换），该柱能有效分离钠离子和FFAs，并成功减少了基质效应。由于其与传统十八烷基硅基（ODS）柱的高度兼容性，可以轻松应用于现有的基于ODS的方法中，这种三模态柱为减轻RPLC-ESI-MS生物分析中钠醋酸根簇引起的基质效应提供了一种有前景的新色谱策略。
引言
在血清、血浆、尿液和唾液等生物基质中定量测定内源性化合物、它们的代谢物和药物对于药代动力学评估、临床诊断和治疗药物监测至关重要。在可用的分析方法中，液相色谱与电喷雾离子化质谱联用（LC-ESI-MS）因其高选择性和灵敏度而被广泛用于生物分析[1]。尽管具有这些优势，但由于基质效应（导致分析物离子抑制或增强）现在被认为是LC-ESI-MS分析中的一个主要问题[2][3][4]，这些不良效应会显著降低分析的灵敏度和准确性[4]。基质效应通常发生在分析物与生物样品中的基质成分共洗脱时，从而导致电喷雾离子化效率降低或增加[4]。已知多种有机和无机物质，包括碳水化合物、胺类、尿素、脂质、肽类及其代谢物和盐类，都会导致基质效应[5,6]。在各种引起基质效应的因素中，像钠离子和钾离子这样的无机碱金属离子在生物基质中普遍存在，它们在ESI-MS中构成重大挑战[7][8][9][10][11]，这些离子常常与分析物和基质成分形成加合物[12][13][14]，从而复杂化光谱解释并因信号强度在多种加合物物种间的分布而降低分析灵敏度[7,15]。它们还与流动相添加剂（特别是在LC-ESI-MS中常用的甲酸盐和醋酸盐离子）相互作用，形成簇离子。在亲水相互作用液相色谱（HILIC）中，这种簇离子的形成尤为明显，因为无机离子会被保留。Carnevale Neto等人[16]在开发用于分析人血浆、血清、尿液和细胞提取物的非靶向代谢组学方法时，报告了由甲酸钠簇[(HCOONa)nNa]+和醋酸钠簇[(CH3COONa)nNa]+产生的色谱峰。这些簇显示出间隔为68和82的等间距质谱，分别对应于甲酸钠和醋酸钠。另一个研究小组也报告了类似的观察结果[14]。Erngren等人[14]在分析头颈部癌细胞系时也报告了相应的钾甲酸盐簇[(HCOOK)nK]+和甲酸钠簇的色谱峰。Erngren的研究表明，这些簇离子的共洗脱会影响与分析物的加合物形成，可能影响分析灵敏度和准确性。这些研究表明，由这些簇离子引起的基质效应在LC-ESI-MS生物分析中越来越受到关注。虽然簇离子的基质效应主要在HILIC中报告，但在其他分离模式（包括反相（RP）LC）中也可能存在问题。在RPLC中，高极性无机离子通常预计会在空体积处洗脱，因此认为它们对基质效应的影响较小[17]。然而，在涵盖广泛极性范围的代谢组学和其他组学分析中[18][19][20][21][22]，接近空体积洗脱的分析物可能容易受到簇离子引起的基质效应的影响[17]。因此，即使在RPLC中也可能存在由簇离子引起的基质效应。鉴于RPLC是生物分析中最常用的分离模式，考虑簇离子的形成并开发缓解相关基质效应的策略非常重要。
为了解决LC-ESI-MS中的基质效应，通常采用同位素标记物质的内标法和标准添加法[23][24][25][26][27]。这些方法可以补偿由基质效应引起的信号变化。然而，当基质效应严重到无法可靠检测分析物信号时，这些校正策略就无效了。因此，在ESI-MS离子化之前，有必要减少或去除导致基质效应的基质成分。
为此，有时会使用液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）[23][24][25][26][27]。然而，在LLE中，高极性分析物可能会与钾离子和钠离子等无机离子一起丢失，这使得该方法不太适合分析亲水化合物。为了解决这个问题，已经探索了离子交换SPE柱来在LC-ESI-MS分析前选择性地去除无机离子[28]。Whiley等人[28]将这种策略应用于人尿液样本进行脱盐，从而提供了一种在LC-ESI-MS分析前去除无机离子的实际方法。基于这些研究，Erngren等人[29]采用这种方法去除钠离子和钾离子，以抑制甲酸钠和醋酸钠簇的形成。结果，他们成功降低了这些簇的信号强度，并部分改善了分析物的响应。然而，SPE过程中所需的多个步骤可能导致样品损失，从而显著影响分析的准确性和精确度[30,31]。
另一种策略是通过改进色谱分离来有效分离分析物和干扰化合物，从而减轻基质效应[24,25]。在这种方法中，优化洗脱条件（包括流动相和固定相）以控制分析物和基质成分的保留行为。多项研究表明，使用梯度洗脱或二维LC可以成功减少基质效应[32][33][34][35]。然而，色谱方法可能具有挑战性，因为它们通常需要相当长的时间进行优化，而且一些用于增强分离的添加剂也可能抑制离子化效率[24,36]。尽管如此，这种方法仍然具有吸引力，因为它不需要复杂的样品预处理。这一优势促使我们探索了一种色谱方法。迄今为止，基于HILIC的色谱法已经研究了固定相类型对钠离子保留的影响[11]。然而，尚未有基于RP的色谱方法被报道用于减轻由簇离子引起的基质效应。
本研究中选择游离脂肪酸（FFAs）作为目标分析物。FFAs是生物上重要的内源性代谢物，在能量代谢、脂质信号传导和各种生理过程中起关键作用。血液和粪便中FFAs水平的改变与癌症、糖尿病、心血管疾病等代谢紊乱有关[37][38][39][40][41][42][43][44][45][46]。因此，准确测定生物基质中的FFAs对于FFAs代谢的临床和基础研究非常重要。长期以来，气相色谱（GC）经过衍生化处理（通常转化为脂肪酸甲酯）一直被认为是FFAs分析的金标准[47]。然而，也探索了无衍生化的方法。例如，GC方法结合顶空固相微萃取（HS-SPME）已被用于通过将这些挥发性化合物提取到顶空来测定粪便样本中的短链FFAs[48,49]。相比之下，长链FFAs的挥发性较低，即使使用HS-SPME也通常需要衍生化[50]。为了克服这一限制，提出了双模式单元固相微萃取（DMU-SPME）。在这种技术中，一半的SPME纤维位于顶空，而另一半直接浸入样品基质中，从而能够在不进行衍生化的情况下同时提取挥发性短链FFAs和不太挥发的长链FFAs[50]。然而，这种方法主要应用于食品分析，其在生物样品中的适用性仍然有限。
在可用的分析技术中，RPLC-ESI-MS最近因无需衍生化即可全面分析FFAs而受到了广泛关注。大多数报道的RPLC-ESI-MS方法使用串联质谱仪[51][52][53][54][55]。然而，由于FFAs在碰撞诱导解离中通常不显示碎片离子[55]，也可以使用更简单的质谱仪进行检测。基于这一概念，我们之前开发了一种使用单四极杆质谱仪的RPLC-ESI-MS方法来测定FFAs，并证明了其适用于食品样本[56]。预计这种分析策略也适用于生物样本。然而，如上所述，RPLC-ESI-MS分析生物基质中的FFAs可能会受到簇离子的复杂影响。由于FFAs的极性范围广泛，全面测定具有挑战性。在使用ODS柱的色谱法中，短链FFAs几乎不被保留，而是在接近空体积处洗脱，因此可能会与钠离子共洗脱，从而可能导致基质效应。
本研究的目的是探讨共洗脱的钠离子对FFAs检测的影响，并建立一种有效的基于RP的色谱方法来减轻这些效应。
化学品和试剂
甲醇（LCMS级，≥99.7%）、醋酸铵（保证试剂级，≥97.0%）、氯化钾（保证试剂级，≥99.5%）、磷酸二氢钾（保证试剂级，≥99.0%）、十二水合磷酸二钠（保证试剂级，≥99.0%）、氯化钠（NaCl，保证试剂级，≥99.5%）、盐酸（HCl，超纯级，35-37%）和牛血清白蛋白（BSA，无脂肪酸，用于生物化学）均购自FUJIFILM Wako Pure
钠离子共洗脱对FFAs峰面积的影响
在我们之前的研究中，开发了一种用于测定咖啡豆和牛奶中短链至长链FFAs的RPLC-ESI-MS方法[56]。当将该方法应用于人血浆时，在总离子色谱图中观察到一个大约持续1.2–3.0分钟的宽峰（图1）。与该峰对应的质谱显示了一系列间隔为82的等间距信号，表明该峰来源于钠醋酸根簇。
钠离子与...
结论
在本研究中，人血浆中的钠离子与FFAs共洗脱，与流动相中的醋酸根离子形成钠醋酸根簇，导致RPLC-ESI-MS中FFAs的离子抑制。为了解决这个问题，发现使用具有反相、阴离子交换和阳离子交换功能的三模态柱（Scherzo SM-C18）是有效的。
作者贡献：CRediT
福岛由纪：概念构思、数据管理、正式分析、研究、方法学、验证、可视化、写作——初稿。山本和宏：概念构思、资金获取、资源提供、监督、写作——审阅和编辑。町田幸一：写作——审阅和编辑。小谷彰：写作——审阅和编辑。箱田英树：写作——审阅和编辑。箱田英树：概念构思、资金获取、资源提供、写作——审阅和编辑、监督、项目管理
资金来源
本研究部分得到了JSPS KAKENHI（资助编号20K15975、23K10810、25K18612）的支持。
数据可用性
数据可应要求提供。
关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了Chat GPT来校对本文的英文。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
CRediT作者贡献声明
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利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
