《Journal of Chromatography A》：Superhydrophobic fluorinated microporous microsphere stationary phase for liquid chromatography separation of highly polar pyrimidine compounds under water mobile phase
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绿色液相色谱分离嘧啶化合物的新策略，基于超亲水氟化微孔微球固定相，在纯水或深熔盐溶剂中实现5-氟尿嘧啶与尿嘧啶的高效分离，比表面积达497.7 m2/g，接触角超150°，背压显著降低，吸附机制包含F-F和F-π相互作用，热力学分析证实自发吸附。
王晓萌|王思雨|徐欣瑞|潘祺伟|陈志勇
山东极端环境耐受性特种化学品重点实验室，济南大学化学与化学工程学院；中国济南250022
摘要
传统的氟化色谱法依赖大量有毒有机溶剂作为流动相，这与可持续发展原则相悖。在此，我们介绍了一种超疏水氟化微孔微球固定相（SFMMS），用于在水基流动相下分离高极性嘧啶化合物。SFMMS具有497.7 m2/g的高比表面积和超高的拒水性（接触角>150°，适用于多种水环境），从而显著降低了反压。在含有少量醋酸或ChCl-EG深共晶溶剂（DES）的强水体系中，实现了胞嘧啶、尿嘧啶和5-氟尿嘧啶的基线分离，这些溶剂属于绿色流动相。热力学分析表明吉布斯自由能变化（ΔG < 0）和焓变（ΔH < 0），表明吸附过程是自发的且由焓驱动。密度泛函理论（DFT）计算得出5-氟尿嘧啶的结合能为-3.05 kcal/mol，支持其通过氟-氟（F-F）和氟-π（F-π）相互作用进行多组分吸附。高比表面积为极性分析物在氟化柱上的长时间保留提供了丰富的结合位点。柱子的重复性通过日内测试的相对标准偏差（RSD）在0.44%至0.56%之间，以及日间测试的RSD在0.61%至1.18%之间得到验证。加标回收实验显示，尿样中5-氟尿嘧啶的平均回收率为80.9%至98.5%，RSD在0.54%至1.80%之间。这项工作为在水基流动相下使用氟化柱分离极性嘧啶提供了一种新策略，符合绿色液相色谱的原则。
引言
液相色谱（LC）作为一种基础分析技术，传统上依赖于有害的有机溶剂（如乙腈、甲醇），这些溶剂对环境和职业健康构成风险[1]。为应对这些挑战，开发绿色流动相已成为推进可持续色谱实践的关键研究方向[[2], [3], [4]]。目前的绿色流动相策略包括低毒有机溶剂[[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]]、离子液体/深共晶溶剂[[14], [15], [16], [17], [18]]以及水基体系[[19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]]。其中，水基体系（如胶束液相色谱（MLC）[19,20]、亚临界水色谱（SWC）[21,22]和过水液相色谱（PALC）[[23], [24], [25]]特别有前景，因为水具有普遍性、成本效益高、无毒性和环境兼容性。这些体系不仅减少了废物处理成本，还提高了操作安全性，成为现代研究人员的理想选择。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种嘧啶类抗代谢药物，广泛用于治疗实体瘤，包括结直肠癌和乳腺癌[26]。对5-FU的治疗药物监测对于优化剂量、减少毒性和改善患者预后至关重要。由于5-FU与其潜在杂质尿嘧啶的结构相似性，这一分析任务具有挑战性。这两种化合物具有几乎相同的嘧啶骨架，仅相差一个氟原子，导致其物理化学性质非常相似。常规液相色谱（NPLC）[[27], [28], [29]]、离子交换液相色谱（IELC）[30,31]和亲水相互作用液相色谱（HILIC）[[32], [33], [34], [35]]已被证明可以有效分离5-FU及其极性嘧啶类似物，但通常需要大量有机溶剂，这与绿色液相色谱的原则相悖。反相液相色谱（RPLC）虽然常用于5-FU分析，但由于5-FU和尿嘧啶的保留时间相近（[[36], [37], [38], [39]]），难以实现有效分离。为了更好地分离5-FU和尿嘧啶，已经探索了几种RPLC方法（见表S1），例如使用串联C18硅胶柱的多柱系统[40]、与Ag负载巯基预柱耦合的硅胶C18柱[41]，以及在高pH条件下操作的聚合物柱（聚（苯乙烯-二乙烯基苯）PS-DVB）[42]。
氟化色谱法研究氟化固定相，被认为是特定类型的RPLC[[43], [44], [45], [46], [47], [48]]。由于氟-氟相互作用，氟化固定相在高水基流动相下应能对氟化化合物产生更长的保留时间[[49], [50], [51], [52]]。迄今为止，只有两项研究探讨了在氟化固定相上分离5-FU和尿嘧啶。Hirayama等人通过悬浮聚合制备了一系列氟化微球固定相（聚（十七氟癸基-乙二醇二甲基丙烯酸酯）微球，并证明在纯水流动相下5-FU的保留时间比尿嘧啶更长[53]。Wang等人在氟化微球固定相（聚（二乙烯基苯-十二氟庚基甲基丙烯酸酯）[54]上也获得了类似的5-FU和尿嘧啶分离效果。然而，这两种方法未能实现基线分离（分辨率< 1.2）。这一限制可能源于氟化聚合物固定相的低比表面积。
在我们最近的研究中，通过系统优化氟化聚合物微球的制备条件，我们利用溶剂热沉淀聚合（SPP）方法将其比表面积提高至400 m2/g[55]。本研究旨在探讨在超水条件下，使用超疏水氟化微孔微球固定相（SFMMS）分离极性嘧啶化合物的效果。SFMMS对不同水基流动相表现出优异的超疏水性，这一点通过溶剂依赖的接触角分析得到了证实。与传统固定相不同，SFMMS在保持高效分离的同时还能降低反压。在绿色流动相下实现了胞嘧啶、尿嘧啶和5-FU的基线分离。通过分子动力学模拟和密度泛函理论（DFT）计算，阐明了SFMMS与分析物之间的分子相互作用机制，为绿色色谱技术的发展提供了理论基础。
材料
二乙烯基苯（DVB，80%二乙烯基苯异构体）、1H,1H,5H-八氟戊基甲基丙烯酸酯（OFPMA）、月桂基甲基丙烯酸酯（LMA）、2,2,2-三氟乙基甲基丙烯酸酯（TFEMA）、乙基甲基丙烯酸酯（EMA）、氯化胆碱（纯度98%）、胞嘧啶（纯度99%）、胞苷（纯度99%）、肌酐（纯度99%）、奥托酸（纯度98%）和尿酸（纯度99%）均购自Macklin Chemistry有限公司（中国上海）。使用前，单体和交联剂均经过处理，确保不含抑制剂。
流动相用固定相的超疏水性
制备的聚合物固定相（P(DVB-OFPMA)微球的平均直径为4.09 μm，多分散性（PDI）为1.07，氟含量为3.88 wt%，比表面积约为500 m2/g（通过氮吸附测定，图S1）。孔径分布主要在0.2至5.0 nm之间，平均孔径为2.5 nm，微孔占总孔结构的17.8%（表S2），显示出良好的稳定性。结论
研究表明，具有高比表面积的超疏水氟化微孔微球固定相（SFMMS）在各种水基流动相下的接触角超过150°，与商用柱相比显著降低了反压。在含有少量醋酸或ChCl-EG深共晶溶剂（DES）的强水体系中，该固定相实现了胞嘧啶、尿嘧啶和5-氟尿嘧啶的基线分离。
作者贡献声明
王晓萌：研究、方法学、验证、初稿撰写、审稿与编辑。王思雨：方法学、验证、初稿撰写。徐欣瑞：数据整理、验证。潘祺伟：方法学、指导、审稿与编辑。陈志勇：概念构思、研究、方法学、指导、初稿撰写、审稿与编辑。
数据可用性声明
本研究的数据可向相应作者索取。作者贡献声明
王晓萌：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学研究。王思雨：初稿撰写、验证、方法学研究。徐欣瑞：数据整理、验证。潘祺伟：审稿与编辑、指导、方法学研究。陈志勇：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、指导、方法学研究、概念构思。利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。致谢
作者感谢山东省自然科学基金（编号ZR2022MB033）和济南大学2023年学科交叉融合建设项目（XKJC-202302）的财政支持。
