一种基于超灵敏花青染料的荧光探针，用于测定三价铁和草酸盐

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：An ultrasensitive cyanine dye-based fluorescent probe for the determination of iron(III) and oxalate

本研究开发了一种基于五甲川吲哚卡红素（Ind2）的超灵敏荧光探针，用于定量检测水溶液中的微量铁(III)和草酸。探针通过酸性条件下的自由基氧化机制实现铁离子的高灵敏检测（LOD 0.05 μM），而草酸则通过抑制铁离子的氧化活性进行检测。实验表明Ind2相较于Ind1和Ind3在铁离子检测中更具优势，且检测限显著低于WHO饮用水铁标准及常见茶中草酸浓度，适用于食品质量和蔬菜监测。

　　

安德烈·R·沙别尔科（Andrii R. Shabelko）| 苏马罗科娃·S·哈利娜（Sumarokova S. Halina）| 齐尔科·S·莱昂内尔（Zinko S. Lionel）| 纳迪亚·A·德雷维扬科（Nadiya A. Derevyanko）| 奥克萨娜·尤·塔纳纳伊科（Oksana Yu. Tananaiko）

基辅塔拉斯·舍甫琴科国立大学（Taras Shevchenko National University of Kyiv），沃洛迪米尔大街64/13号，基辅01601，乌克兰

摘要

开发了一种基于五甲川吲哚菁染料（Ind2）的超灵敏荧光探针，用于定量测定水溶液中的微量铁(III)和草酸盐。分析原理基于在酸性条件（pH 1.9 ± 0.05）下Fe³⁺通过自由基氧化导致Ind2荧光淬灭的现象；而草酸盐的测定则依赖于Fe³⁺氧化活性的降低。高分辨率质谱（HRMS）分析证实了染料自由基阳离子的形成，随后多甲川链发生断裂。比较研究表明，五甲川染料（Ind2）作为Fe³⁺检测试剂比三甲川（Ind1）和七甲川（Ind3）吲哚菁染料更有效。

该探针在铁(III)浓度为0.1–1.1 μM（R² = 0.9968）和草酸盐浓度为0.1–1.8 μM（R² = 0.9987）的范围内表现出优异的线性，两种离子的检测限均为0.05 μM。这些数值远低于世界卫生组织对饮用水中铁的推荐浓度（5.4 μM）以及红茶浸出液中典型的草酸盐水平（约430–9200 μM）。该探针具有良好的选择性，仅受到能与Fe³⁺形成竞争性复合物的阴离子（F^?和H₂PO₄^?）的干扰。该探针在红光区域（约655 nm）工作，具有高灵敏度，并可在含乙醇（<1% v/v）的水介质中发挥作用。

该探针已成功应用于检测酸模中的Fe³⁺和茶浸出液中的可溶性草酸盐，显示出在叶类蔬菜中铁和草酸盐监测以及食品质量控制方面的强大潜力。

引言

由于吲哚菁染料具有极高的摩尔消光系数（通常为n × 10⁵ L·mol^?1·cm^?1）、在可见光和近红外区域的强吸收、结构可调性以及在水中表现出强烈荧光的能力[1]，因此在分析化学中受到了广泛关注。在有机发光体中，吲哚菁染料因其可调的吸收和发射光谱、高摩尔消光系数以及可调节的溶解性和生物相容性而特别适用于化学传感[2]。因此，已经开发了许多基于吲哚菁的分析探针，用于检测多种有机（如核酸、蛋白质和淀粉样结构）[2]和无机分析物（如亚硝酸盐[3]、过氧化氢[4]、次氯酸盐[5]、氟化物[6]、氰化物[7]以及铜和锌离子[8]）。

铁是一种重要的微量营养素，参与氧气运输、电子转移以及其他代谢和酶促过程。铁的缺乏或过量都可能有害：摄入不足是全球主要的健康问题，会导致贫血；而过量摄入则可能导致中毒效应和严重疾病，如血色素沉着症[9][10]。草酸盐是一种内源性代谢产物，也是许多植物性食物中的天然成分。尽管在低浓度下无毒，但草酸盐水平升高会导致草酸钙晶体的形成，从而引发肾结石、肾脏炎症和矿物质吸收障碍。饮食中草酸盐摄入过量、代谢紊乱或胃肠道菌群失调可能导致高草酸尿症，增加患病风险[11][12]。因此，在环境、食品和生物样本中准确灵敏地检测这两种物质具有重要的分析意义。

经典的铁(II/III)检测方法包括基于1,10-菲罗啉或硫氰酸盐的分光光度法，以及原子吸收光谱法。菲罗啉方法的检测限（LOD）通常在0.2–2 μM范围内，具体取决于样品基质和分析条件[13][14]。然而，这种方法存在一些缺点：1,10-菲罗啉具有毒性（LD₅₀ = 132 mg/kg）[15]，需要大量试剂且试剂纯度要求高；必须先将Fe³⁺还原为Fe²⁺（通常使用羟胺）；在微量铁水平下灵敏度较低；此外，氰化物、亚硝酸盐、磷酸盐和各种过渡金属离子（如钴、镍、铜、铋和银）的基质干扰会影响结果的重复性[16]。硫氰酸盐方法的灵敏度较低，且对基质组成和分析条件依赖性强；在纯水介质中进行的常规比色法中，LOD约为1.8 μM[17]。此外，Fe–SCN复合物在水体系中不稳定，分析信号对酸度和离子强度的依赖性强，且易受铜和钴等竞争性金属离子以及磷酸盐、氟化物等能形成稳定铁复合物的配体的强烈基质干扰[16]。未经预浓缩的火焰原子吸收光谱法的LOD约为1.8 μM[18]，可能不足以检测微量铁；其准确性还可能受到基质的影响，尤其是在存在硫酸盐和磷酸盐等难溶性阴离子的情况下。

对于超纯水的监测，特别是电子工业中的微电路和半导体制造，灵敏的铁分析技术尤为重要，因为即使微量的铁也会引起腐蚀、催化氧化反应并改变薄膜的电学性质[19]。根据ASTM D5127–13[20]标准，超纯水中的铁浓度应低于0.9 μM，这接近或低于许多传统分析方法的检测限，因此需要更灵敏的铁定量方法。近年来，基于荧光的方法越来越受到重视。例如，一种基于苯并咪唑的荧光探针[21]可实现快速（7分钟）且灵敏（LOD = 0.021 μM）的铁检测；然而，它需要主要是有机介质（EtOH/H?O = 9:1，v/v）并且发射波长较短（λ_em = 466 nm），这增加了对基质干扰的敏感性。另一种灵敏的探针（LOD = 0.27 μM）[22]需要近紫外光激发（λ_ex/λ_em = 330/460 nm），这会增加有机基质的吸收和荧光重叠，从而增强基质干扰。

最常见的草酸盐检测方法包括高锰酸盐法[23]、离子色谱法[24]和光谱技术[25]。高锰酸盐法的灵敏度较低（最低可滴定浓度约为0.1–0.3 μM），操作繁琐，并受多种干扰物质的影响，包括有机酸、Fe³⁺、NO₂^?、SO₃^2?、还原剂和抗氧化剂。离子色谱法需要昂贵的仪器和耗材，且植物材料（如果胶和多酚）复杂的基质会迅速破坏色谱柱，除非进行广泛的样品预处理。因此，基于指示剂置换测定（IDA）策略的光谱和荧光方法受到了越来越多的关注。例如，在一项研究中[26]，提出了一种基于Fe(III)–磺osalicylate体系的比色化学传感器用于草酸盐检测；然而，其LOD为8.2 μM，可能不足以分析某些食品和植物材料，尤其是在稀释后。在另一项研究中[27]，一种基于量子点的CSi荧光探针能够检测低至0.08 μM的草酸盐，但该方法需要复杂的CSi复合体的多步合成。因此，开发简单、灵敏且选择性的草酸盐检测方法仍然是一个重要的分析挑战。

本研究介绍了一种使用吲哚菁染料的荧光淬灭方法来检测氧化剂（以铁(III)为例），并展示了其在草酸盐分析中的适用性。近年来已有几项关于基于吲哚菁染料的铁检测的研究报道。例如，在[28]中，通过分光光度法检测Fe³⁺，LOD为0.16 μM，该方法基于吲哚咔arbocyanine染料的氧化导致光密度降低；然而，反应途径未经过实验验证，可能产物的分析仅限于量子化学计算。在[29]中，一种组装在稀土掺杂上转换纳米粒子（UCNPs）上的Schiff碱荧光吲哚菁探针实现了0.21 μM的LOD；但其多步合成和对昂贵稀土纳米材料的依赖性大大限制了实际应用。另一项基于Fe³⁺对吲哚菁染料荧光淬灭的研究[30]表明形成了1:1复合物，但未提供确凿的实验证据，且报告的LOD（6.8 μM）高于传统方法。相比之下，尽管吲哚菁染料在草酸盐检测方面具有分析潜力，但相关文献中尚未报道基于其的方法。

材料

所有化学品和溶剂均为分析级，购自Sigma-Aldrich，无需进一步纯化即可使用。九水合硝酸铁(III)（Fe(NO₃)₃·9H₂O，Sigma-Aldrich）用作方法开发中的铁(III)离子（Fe³⁺来源。通过将2.1820 g的Fe(NO₃)₃·9H₂O溶解在100 mL的0.1 M HNO₃中制备了0.054 M的储备溶液。使用磺osalicylic酸作为指示剂，通过络合滴定法验证了精确浓度[31]。

结果与讨论

本研究的主要对象是阳离子五甲川吲哚菁染料[33]（记为Ind2），用作铁(III)和草酸盐的荧光检测试剂。为了研究多甲川链长度的影响，还使用了相应的同系物Ind1和Ind3。在吲哚菁染料同系物中，Ind2具有中等的多甲川链长度，以及介于三甲川（Ind1）和七甲川之间的疏水性和聚集行为。

结论

所开发的方法证明了基于吲哚菁染料自由基氧化的高灵敏度铁(III)检测的可行性。该方法还首次展示了利用铁(III)在草酸盐存在下的氧化活性降低来检测草酸盐的实例，这可能为未来阴离子探针的开发提供一个平台。两种方法均达到了0.05 μM的相同检测限（LOD），大约是传统方法的8600倍。

CRediT作者贡献声明

安德烈·R·沙别尔科（Andrii R. Shabelko）：概念构思、方法学设计、验证、数据分析、原始草稿撰写、可视化。齐尔科·S·莱昂内尔（Zinko S. Lionel）：方法学设计、撰写及审稿编辑。纳迪亚·A·德雷维扬科（Nadiya A. Derevyanko）：资源获取、撰写及审稿编辑。奥克萨娜·尤·塔纳纳伊科（Oksana Yu. Tananaiko）：概念构思、方法学设计、撰写及审稿编辑、项目监督。

参与同意

本文不包含任何作者参与的动物实验。

出版同意

手稿中提到的所有作者均已同意提交和发表本文。

伦理批准

本文不包含任何作者参与的动物实验。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究未获得公共、商业或非营利机构的任何特定资助。本文的工作得到了乌克兰国家科学院有机化学研究所的支持。

我们感谢已故的亚历山大·A·伊什琴科（Alexander A. Ishchenko）教授对本文科学背景的深刻讨论和宝贵贡献。同时，我们也感谢Enamine有限公司提供的HPLC-MS数据收集支持。