一种源自噻吩的荧光探针，具有长发射波长，可用于高灵敏度检测肝素和鱼精蛋白

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A terthiophene-derived fluorescent probe with long-emission wavelength for highly sensitive detection of heparin and protamine

肝素和精胺的荧光检测探针研究：基于长波长阳离子探针3T-TAPP，通过H型聚集荧光淬灭实现肝素检测，精胺因更强结合力释放探针使荧光恢复，灵敏度高且在复杂生物环境中稳定。

　　

Gongli Wei|Ying Feng|Li Zhao

北京工商大学轻工学院，中国北京102488

摘要

肝素和鱼精蛋白的测定在临床医学中具有重要意义。本文设计了一种基于长波长阳离子探针的有效荧光传感策略。将4-甲基-1-(3-(三甲基氨基)丙基)吡啶-1-鎓溴化物（TAPP）结构引入噻吩（3T）中，制备出一种具有红色发射的阳离子荧光探针（3T-TAPP）。由于3T-TAPP与肝素之间的静电结合，导致其红色发射被抑制。该探针在HEPES缓冲液和10%血清中的肝素检测灵敏度和选择性均令人满意。此外，3T-TAPP/肝素复合物对鱼精蛋白也具有传感能力。由于鱼精蛋白与肝素的结合亲和力更强，3T-TAPP会从复合物中释放出来。这一现象在HEPES缓冲液和10%血清中同样得到验证。本研究提出了一种用于生物分子检测的红色发射探针的构建策略。

引言

肝素是一种强酸性的硫酸化多糖，最初在肝脏中被发现[1]。它也存在于其他组织中，包括肺部、血管壁和肠黏膜。在这些组织中，其聚合物结构使其能够作为动物的天然抗凝剂[2]。在临床实践中，肝素被广泛用于预防血栓形成、治疗弥散性血管内凝血，并在体外手术期间提供抗凝作用。精确的剂量控制对于避免过量使用引起的不良事件（如出血）至关重要[3]。在临床医学中，鱼精蛋白作为肝素的解毒剂使用。这种碱性蛋白质存在于成熟鱼精细胞的细胞核中，能与DNA结合形成核蛋白[4]。过量使用鱼精蛋白可能导致各种并发症，这突显了准确测量肝素和鱼精蛋白浓度的重要性。

荧光探针方法是检测肝素和鱼精蛋白的一种特别值得注意的方法。该方法具有响应速度快、灵敏度高和操作简单的特点，吸引了众多研究人员的关注[5]、[6]、[7]、[8]。已经有多种用于检测肝素和鱼精蛋白的荧光探针被报道[9]、[10]、[11]。这些探针主要包括有机染料或其自组装体[12]、[13]、[14]、[15]、量子点[16]、[17]以及聚合物[18]、[19]、[20]。然而，这些系统存在一些局限性，例如发射波长低于500纳米[21]、[22]、[23]。研究表明，生物样本通常在大约510纳米处表现出自发荧光。在较长波长下工作的探针受到的干扰较少，从而提高了其灵敏度和抗干扰能力[24]。因此，使用长波长荧光探针可以克服这一限制，提高检测灵敏度和抗干扰能力[25]、[26]。

通过适当的分子修饰，可以开发出具有长发射波长的荧光探针。通过分子设计延长荧光团的π共轭结构已被证明是创建具有更长发射波长的可切换荧光探针的有效策略[27]、[28]、[29]、[30]。已有几种显示红移发射的荧光探针被报道[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。这一观察结果强调了在该领域继续研究的必要性。

在本研究中，合成了一种源自噻吩的化合物（E）-4-(2-([2,2′:5′,2″-噻吩]-5-基)乙烯基)-1-(3-(三甲基氨基)丙基)吡啶-1-鎓溴化物（3T-TAPP），并将其用作荧光探针，构建了一种用于灵敏检测肝素和鱼精蛋白的红色发射传感系统（方案1）。3T-TAPP的设计采用了“供体-受体”策略，以实现红色区域的扩展发射。引入4-甲基-1-(3-(三甲基氨基)丙基)吡啶-1-鎓溴化物（TAPP）提供了π电子受体[36]。同时，提高了探针在水溶液中的溶解度。TAPP结构中的两个正电荷位点使其能够静电吸附到肝素链上。因此，3T-TAPP分子的靠近导致荧光信号“关闭”，从而实现肝素的定量检测。此外，鱼精蛋白以更高的结合亲和力与肝素结合，促使3T-TAPP分子释放。鱼精蛋白的加入会引起荧光信号“开启”，表明成功检测到了3T-TAPP-肝素复合物中的鱼精蛋白。3T-TAPP是一种有前景的高性能候选探针，适用于复杂生物环境中肝素和鱼精蛋白的定量检测。

材料

噻吩购自濮阳汇成电子材料有限公司。肝素钠、血红蛋白（来自牛血）、溶菌酶、L-精氨酸、卵白蛋白、3-溴丙基三甲基铵溴化物、腺苷5′-三磷酸二钠（ATP）、胃蛋白酶和维生素C（VC）由中国Macklin公司提供。透明质酸（HA）、硫酸鱼精蛋白、硫酸软骨素A钠盐（Chs）、氧氯化磷和4-甲基吡啶由中国MREDA公司提供。

3T-TAPP的光物理性质

使用吸收光谱和荧光光谱研究了3T-TAPP的光物理性质。如图1a所示，最大吸收峰出现在470纳米，最大发射峰出现在670纳米。插图显示了探针溶液在紫外光照射下的照片。与噻吩本身的光谱[38]、[39]相比，其吸收和发射波长均发生了显著的红移。

结论

总结来说，合成了一种源自噻吩的阳离子荧光探针。该探针被开发用于检测肝素和鱼精蛋白。采用“供体-受体”设计策略实现了红色区域的扩展发射。该探针以“面对面”的方式与肝素静电结合，在HEPES缓冲液和10% FBS中产生灵敏且选择性的“关闭”荧光响应。探针的检测限（LOD）非常低。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

感谢国家重点研发计划（2017YFB0308701）和“十三五”期间北京市属高校高层次教师支持项目（CIT&TCD201804026）的财政支持。