《Aquaculture》：Development and evaluation of two colloidal gold lateral flow test strips for large Yellow Croaker Iridovirus (LYCIV) detection
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本研究成功开发两种大型黄颡鱼虹彩病毒（LYCIV）快速检测试纸，包括抗原检测和抗体检测两种类型。抗原试纸对组织匀浆检测限为103拷贝/μL，抗体试纸可特异性检测血清中LYCIV抗体，两者均无交叉反应，且特异性较PCR高，适用于现场即时诊断，为LYCIV防控提供便捷工具。
作者：曹勇 | 王增凯 | 刘慧敏 | 范中宇 | 陈明超 | 卢立群 | 胡坤 | 江有生
上海海洋大学国家水生动物病原体收集中心，中国上海市201306
摘要
大黄鲈（Larimichthys crocea）是中国最重要的海水养殖物种之一。近年来，大黄鲈虹彩病毒（LYCIV）导致了大量养殖的大黄鲈死亡，因此迫切需要快速便捷的诊断方法。本研究开发了两种针对LYCIV的单克隆抗体（mAbs），分别针对其肉豆蔻酰化膜蛋白（MMP）和锚蛋白重复序列蛋白（ARP）。同时，还制备了一种针对大黄鲈IgM的多克隆抗体（pAb）。利用这些抗体，制备了两种能够快速检测LYCIV感染的胶体金免疫层析试纸。抗原检测试纸对感染鱼的组织匀浆的检测限为10^3拷贝/μL，并且与其他常见水生病原体无交叉反应。抗体检测试纸用于检测大黄鲈血清中的LYCIV特异性抗体，也未与异源阳性血清（如感染CyHV-2的鲫鱼Carassius auratus、感染ISKNV的锦鲤Siniperca chuatsi、感染LMBV的大口黑鲈Micropterus salmoides、感染GCRV-II的草鱼Ctenopharyngodon idella或感染IHNV的虹鳟Oncorhynchus mykiss）产生交叉反应。在疑似LYCIV暴发的养殖场样本检测中，基于抗原和抗体的LFIAs与PCR的特异性均为100%。这两种试纸可用于检测有症状的鱼类以及判断无症状鱼类是否感染LYCIV。这些简单、快速、灵敏的试纸便于在现场进行LYCIV诊断。
引言
大黄鲈是中国水产养殖中广泛养殖且经济价值较高的海洋鱼类，2023年的捕捞量为39,000吨（中国农业农村部，2024年数据）。然而，由于大黄鲈采用开放式网箱养殖方式，养殖操作容易受到多种病原体的影响（Mu, 2011; Zhang et al., 2013）。早在1999年，电子显微镜就证实了福建省夏季大黄鲈高死亡率疫情的病原体是一种虹彩病毒（He et al., 1999）；随后研究证实，福建省幼鱼的夏季大规模死亡是由该病毒引起的，并正式将其命名为大黄鲈虹彩病毒（LYCIV）（Chen et al., 2003）。LYCIV在高温夏季具有季节性流行特征，主要影响体长10–15厘米的幼鱼。近年来，福建的大黄鲈养殖场多次发生LYCIV感染，严重疫情下的累计死亡率超过50%（Hong et al., 2018; Chen et al., 2003）。一旦出现临床症状，若不及时控制，病毒会在养殖场内大规模传播，甚至扩散到邻近养殖场。
LYCIV属于虹彩病毒科（Iridoviridae）中的Megalocytivirus属，是一种线性双链DNA病毒，呈二十面体结构，直径约为120纳米。福建株LYCIV的全基因组测序显示其基因组长度为111,767 bp，包含126个开放阅读框（ORFs）（Chen et al., 2003）。舟山株LYCIV的全基因组测序结果为112,043 bp，包含120个ORFs，其中43个与其它虹彩病毒的基因具有高度同源性（Wang et al., 2022）。
目前，LYCIV的诊断方法主要包括电子显微镜（He et al., 1999）、常规聚合酶链反应（PCR）（Chen and Dong, 2005）、定量聚合酶链反应（qPCR）（Wang et al., 2006）以及细胞培养中的病毒分离（Yang et al., 2023）。尽管细胞培养中的病毒分离是确诊的金标准，但由于核酸扩增方法（尤其是qPCR）具有高分析灵敏度和特异性，因此被广泛用于LYCIV的检测。然而，这些方法通常需要专门的实验室、专用仪器和训练有素的人员，且检测周期较长，限制了其在非集中式设施中的应用。侧向流动免疫分析（LFIA）是一种基于特异性抗原-抗体相互作用的快速现场检测技术。与传统实验室检测方法相比，LFIA成本低廉、操作简便、用户友好、可快速提供现场结果，并提供直观的读数。LFIA已被广泛应用于水生动物病毒的快速现场检测。已有研究表明，抗原检测LFIA可用于检测多种水生病原体，如传染性造血坏死病毒（IHNV）（Kim et al., 2025）、锦鲤疱疹病毒3型（KHV/CyHV-3）（Zheng et al., 2023a）和白斑综合征病毒（WSSV）（Kulabhusan et al., 2017）。为了评估先前的暴露情况并支持感染早期或低拷贝阶段的流行病学监测，还开发了抗体检测LFIA。对于ISKNV，利用主要衣壳蛋白（MCP）作为涂层抗原的胶体金试纸可半定量评估血清抗体水平（Ji et al., 2025）；对于鲤疱疹病毒2型（CyHV-2），开发了一种快速试纸，通过金标记的病毒颗粒检测鲫鱼中的CyHV-2特异性IgM（Sun et al., 2023）。本文利用两种LYCIV特异性单克隆抗体和一种针对大黄鲈IgM的多克隆抗体，开发了两种LFIA：一种血清学试纸用于检测抗LYCIV IgM，另一种抗原检测试纸用于检测LYCIV本身。这两种试纸的结合使用可以更方便地监测LYCIV感染情况，从而为LYCIV的预防和控制提供更好的方法。
重组蛋白的克隆、表达与纯化
根据LYCIV的编码序列（GenBank登录号OL774653.1）和大黄鲈截短IgM区域的cDNA序列（GenBank登录号OP950822.1）设计了引物（表1）。正向引物的5′端和反向引物的3′端分别加入了EcoRI和XhoI识别位点。使用LYCIV基因组DNA作为模板，通过PCR扩增目标片段。按照制造商的说明，从肝脏和肾脏中分离总RNA。
重组蛋白的表达与纯化
使用相应的引物对，扩增出目标基因（如图8所示），并将纯化的扩增产物连接到表达载体pET-32a(+)中。如图1所示，重组蛋白在E. coli BL21(DE3)中成功表达。溶解度分析表明，重组MMP和IgM蛋白主要以包涵体的形式存在，而重组ARP蛋白则存在于可溶性组分中（图1A, B）。
讨论
迄今为止，大多数关于LYCIV的研究都集中在全基因组水平；与其他Megalocytivirus属成员相比，针对LYCIV的蛋白质水平研究仍然有限且不够系统。目前对LYCIV的研究主要限于少数个别蛋白质的克隆、表达或初步功能分析，例如主要衣壳蛋白（MCP）和ATP酶（Ao and Chen, 2006; Wang and Chen, 2004; Yang et al.
作者贡献声明
曹勇：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证。
王增凯：撰写 – 审稿与编辑，验证，数据管理。
刘慧敏：验证，数据管理。
范中宇：验证，数据管理。
陈明超：验证，数据管理。
卢立群：监督，资源获取，资金筹集。
胡坤：监督，资源获取，资金筹集。
江有生：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，资源管理，方法学设计，资金筹集。
未引用的参考文献
Han et al., 2022
Yang et al., 2026
Ye, 2012
Zhang and Hong, 2015
Zheng et al., 2023b
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2019YFD0900101）和江苏省重大水生动物病毒性疾病快速诊断技术研发与应用项目（BE2021369）的支持。
