通过微生物发酵提高菜豆渣的利用率：β-半乳聚糖的分离及其免疫刺激潜力

《Carbohydrate Polymers》：Enhanced utilization of okara through microbial fermentation: Isolation and immunostimulatory potential of a β-galactan

大豆麸皮经乳酸乳球菌固态发酵制备β-1,4-半乳糖聚糖LPP-A，作为疫苗佐剂可显著增强小鼠OVA特异性细胞和体液免疫应答，抑制EG7-OVA肿瘤生长，为大豆副产品高值化利用提供新途径。

　　

徐雅媛|高雅楠|董慧玲|李东琦|程正阳|万雅琼|吴宣军|程江华

安徽省农业科学院农产品加工研究所，合肥，230001，中国

摘要

豆渣是大豆加工的副产品，可以通过微生物发酵转化为具有生物活性的化合物。在本研究中，我们使用了一种常用于益生菌和乳制品发酵的革兰氏阳性乳酸菌Lacticaseibacillus paracasei对豆渣进行固态发酵。随后通过DEAE Sepharose Fast Flow和BioGel P-2凝胶过滤色谱法纯化了粗多糖，得到了一种高纯度的β-1,4-半乳聚糖（LPP-A），其平均分子量为6 kDa。为了评估其免疫刺激潜力，我们在以卵清蛋白（OVA）为抗原的小鼠免疫模型中测试了LPP-A作为佐剂的效果。接种了OVA和LPP-A的小鼠表现出强烈的OVA特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应和高水平的IgG抗体，表明其能诱导强烈的抗原特异性细胞和体液免疫反应。在随后的肿瘤挑战实验中，OVA加LPP-A组显著抑制了EG7-OVA肿瘤的生长，表明LPP-A作为癌症免疫治疗的免疫增强佐剂具有巨大潜力。这些结果表明，发酵豆渣可以产生具有强效疫苗佐剂特性的β-1,4-半乳聚糖（LPP-A），支持其在基于蛋白质的免疫策略中的价值。

引言

多糖是一类广泛存在于自然界中的生物大分子，由通过糖苷键连接的单糖组成，在免疫激活中起着重要作用（Dwek, 1996; Ferreira, Passos, Madureira, Vilanova, & Coimbra, 2015）。来自不同来源的多糖可以通过多种机制增强机体免疫力，包括激活巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞（Shin, Hwang, Yoon, Kim, & Shin, 2017; Tabarsa et al., 2019）、改善吞噬细胞功能（Sheng et al., 2017）、促进T淋巴细胞增殖（Sun et al., 2015; Zhao et al., 2017）以及上调细胞因子、抗体和补体的分泌（Sun et al., 2018）。多糖还可以作为疫苗佐剂来启动先天免疫并增强适应性免疫反应（Cui et al., 2025; Pi et al., 2014; Sun et al., 2018）。树突状细胞（DCs）是关键的抗原呈递细胞，其成熟程度直接影响免疫反应的强度和方向。研究表明，来自Achyranthes bidentata的多糖可以通过增加CD86、CD40和MHC-II的表达以及刺激IL-12的分泌来调节DC的成熟（Zou et al., 2011）。来自Phoma herbarum和Mori fructus的多糖也显示出类似的效果（Chen et al., 2014; Shin et al., 2013; Zou et al., 2011）。值得注意的是，多糖可以从豆渣等食品残渣中制备，这通过将低价值副产品转化为高价值的功能性产品，展示了显著的资源利用价值。

豆渣是大豆加工生产豆浆和豆腐的副产品，富含膳食纤维、蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质（Asghar et al., 2023; Rahman, Mat, Ishigaki, & Akashi, 2021）。研究表明，豆渣作为膳食补充剂有助于促进肠道微生物的生长，并有助于预防糖尿病、肥胖症和高脂血症等疾病（Lesa et al., 2023; Swallah, Fan, Wang, Yu, & Piao, 2021）。尽管具有这些潜力，但由于豆渣纤维粗糙、质地坚硬、有豆腥味以及储存困难，其利用率较低。因此，寻找豆渣的用途对大豆产品行业至关重要。微生物发酵在豆渣的高效利用中发挥着重要作用（Colletti, Attrovio, Boffa, Mantegna, & Cravotto, 2020）。细菌、真菌和酵母因其增强生物活性化合物和加强生理效应的潜力而被广泛研究（Colletti, Attrovio, Boffa, Mantegna, & Cravotto, 2020; Gupta, Lee, & Chen, 2018; Hadj Saadoun et al., 2021; Hu, Chiu, Christianty, & Chen, 2022; Keong, Toh, Lu, & Liu, 2023; Queiroz Santos et al., 2018; Vong, Hua, & Liu, 2018; Vong, Lim, & Liu, 2017; Voss, Monteiro, Jauregi, Valente, & Pintado, 2021）。例如，使用Rhizopus azygosporus进行发酵可以增加豆渣中的γ-氨基丁酸、粗多糖和异黄酮苷元，从而增强血管紧张素转换酶抑制和抗氧化作用（Hu, Chiu, Christianty, & Chen, 2022）。此外，用Saccharomyces cerevisiae发酵豆渣不仅可以提高蛋白质含量、酚类物质水平和抗氧化能力，还可以促进异黄酮水解为其苷元形式（Queiroz Santos et al., 2018）。在豆渣发酵过程中，微生物会分泌如β-葡萄糖苷酶等糖苷酶，这些酶可以水解糖苷并提高营养物质的生物利用率（Marazza, Nazareno, Savoy de Giori, & Garro, 2012; Su et al., 2021）。

豆渣的微生物发酵可以产生具有有益生物活性的多糖，包括抗氧化和免疫调节作用（Huang et al., 2022; Li et al., 2013; Shi, Yang, Guan, Zhang, & Zhang, 2012; Shi, Yang, Hu, & Zhang, 2014）。然而，目前尚未有关于通过发酵豆渣获得具有强免疫刺激活性的均聚多糖的报道。为了填补这一空白，我们分别使用九种微生物菌株对豆渣进行了生物发酵。通过测定粗多糖的产量，我们发现Lacticaseibacillus paracasei（旧称Lactobacillus paracasei）是一种表现优异的菌株。用该菌株发酵豆渣后，通过DEAE和BioGel P-2色谱法分离并纯化了粗多糖，得到了一种高纯度的均聚多糖。这种多糖作为疫苗佐剂表现出优异的免疫激活特性。总体而言，我们的发现为提高疫苗效力提供了新的策略，并为豆渣的高价值利用奠定了坚实的基础。

实验材料

新鲜豆渣购自安徽大富食品有限公司。该豆渣来自中国安徽省合肥地区的Zhonghuang 901大豆品种，这是一种该地区的高品质品种。新鲜豆渣经过高压灭菌处理，在65°C下干燥并粉碎，然后通过60目筛子过滤得到粉末，并在4°C下储存以备后续使用。特定的无特定病原体（SPF）雌性C57BL/6小鼠（6-8周龄）购自济南鹏跃实验动物繁殖有限公司。

多糖的制备、纯化和表征

在我们的实验室中分离出的九种不同微生物菌株的作用下（详见实验材料部分），豆渣在60%的水分含量和6%的接种量下发酵了6天。根据粗多糖的产量（图1），L. paracasei LMX1被确定为最有效的菌株，因此被选用于所有后续实验。此外，还进行了单因素实验，以研究接种量、发酵时间和水分的影响

结论

总之，本研究成功从用L. paracasei发酵的豆渣中分离并结构表征了高纯度且分子量相对均匀的β-1,4-半乳聚糖LPP-A。我们证明了LPP-A能有效促进BMDCs和巨噬细胞的成熟，从而导致T细胞的激活和强烈的免疫刺激作用。当作为OVA基肿瘤模型中的疫苗佐剂使用时，LPP-A显著增强了细胞和体液免疫

作者贡献声明

徐雅媛：撰写 – 原稿、方法学、资金获取、数据分析、概念构思。高雅楠：撰写 – 原稿、方法学、数据分析。董慧玲：撰写 – 原稿、方法学、数据分析。李东琦：方法学、数据分析。程正阳：方法学、数据分析。万雅琼：数据分析。吴宣军：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调，

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了科学技术部的重点专项项目（SQ2020YFF0404523，资助人：程正阳）、皖北大豆优势特色产业集群项目（2023CYJQ013，资助人：程正阳）、安徽省农业科学院的青年人才计划（编号：QNYC-202122，资助人：程正阳）、安徽省政府资助的农业科技成果转化项目（2025AHSZH18，资助人：徐雅）、以及泰山的支持。