《Cellular Signalling》：Analysis of paired primary-metastatic renal cancer lesions reveals RCN3-MMP10 axis facilitates lung metastasis
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摘要
肾细胞癌（RCC）肺转移的预防措施以及转移性RCC的有效治疗是目前尚未满足的临床需求。配对原发RCC与肺转移灶的DNA甲基化谱仍不清楚，这可能有助于发现新的生物标志物和治疗靶点，以限制肾癌的转移。本研究对配对的原发RCC及肺转移灶进行了扩展代表性亚硫酸氢
摘要
肾细胞癌（RCC）肺转移的预防措施以及转移性RCC的有效治疗是目前尚未满足的临床需求。配对原发RCC与肺转移灶的DNA甲基化谱仍不清楚，这可能有助于发现新的生物标志物和治疗靶点，以限制肾癌的转移。本研究对配对的原发RCC及肺转移灶进行了扩展代表性亚硫酸氢盐测序和转录组测序，以识别与DNA甲基化相关的转移相关基因。在这些基因中，网状钙蛋白3（Reticulocalbin 3, RCN3）与RCC进展相关。研究人员发现，启动子低甲基化能够上调RCN3的表达。RCN3的上调在体外能够促进RCC的恶性表型，同时在体内促进RCC肺转移。研究也证明RCN3通过其EF-hand 5-6结构域与MMP10相互作用，促进MMP10的分泌并激活PI3K/Akt通路。最后，研究人员鉴定出羧基-吡哆司他丁2HCl（Carboxy-pyridostatin 2HCl）可能通过结合在RCN3和MMP10结合界面的口袋来抑制RCC的转移。总之，这些发现表明RCN3在RCC肺转移中发生低甲基化并上调表达，在RCC肺转移中扮演重要角色，可能作为一个潜在的治疗靶点。
一、 研究背景、问题与目的
转移是癌症死亡的主要原因，肾细胞癌（RCC）作为泌尿系统常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势。尽管靶向治疗和免疫治疗的进展已可延长转移性RCC患者的生存期，但对于高危局限性RCC的辅助治疗临床试验大多不成功，预防RCC肺转移的有效措施仍然匮乏。肺是RCC最常见的转移部位，因此，研究同一患者的原发RCC和肺转移灶对阐明转移机制至关重要，但获取此类配对样本存在挑战。DNA甲基化是最广泛研究的表观遗传修饰，其在RCC中的作用备受关注，但关于配对原发与转移灶的DNA甲基化谱研究尚不充分。本研究旨在通过对配对的原发RCC和肺转移病灶进行多组学分析，揭示驱动肺转移的表观遗传和分子机制，以发现新的生物标志物和治疗靶点。本论文发表于《Cellular Signalling》期刊。
二、 主要技术方法
研究人员利用瑞金医院2013年至2021年间接受手术的10例透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者的配对原发灶和肺转移灶（FFPE样本），进行了扩展代表性亚硫酸氢盐测序（XRBS）和RNA测序（RNA-seq）。通过生物信息学分析筛选候选基因，并利用TCGA-KIRC队列数据进行验证。在体外，通过构建RCN3过表达和敲低的稳转肾癌细胞系，使用CCK-8、EdU、划痕愈合、Transwell、流式细胞术（检测失巢凋亡）等实验评估细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。在体内，通过尾静脉注射过表达RCN3的786-O-luc2细胞至裸鼠，利用活体成像和组织学染色观察肺转移情况。分子机制研究方面，采用免疫共沉淀（IP）、Flag pull-down、数据非依赖采集质谱（DIA-MS）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光等技术探究RCN3与MMP10的相互作用及对PI3K/Akt通路的激活。此外，通过HADDOCK进行蛋白质对接预测，并利用虚拟筛选和表面等离子共振（SPR）技术筛选靶向RCN3-MMP10相互作用的小分子抑制剂。
三、 研究结果
3.1. DNA甲基化谱分析揭示转移相关通路
对10对配对样本的XRBS分析发现，肺转移灶与原发灶之间存在9001个差异甲基化区域（DMRs），其中1200个位于启动子区。启动子区含DMRs的基因富集于肿瘤转移相关通路，如PI3K/Akt通路和MAPK通路。
3.2. 多组学整合鉴定RCN3为关键候选基因
通过整合DNA甲基化与转录组数据，并利用TCGA-KIRC队列临床数据筛选，研究人员鉴定出RCN3。RCN3在肿瘤中表达显著高于正常组织，高表达与不良预后相关，且其表达与启动子甲基化水平呈负相关。细胞实验证实，DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-Aza）处理可上调RCN3表达，验证了其表达受DNA甲基化调控。
3.3. RCN3在体外促进RCC恶性进展
功能实验表明，敲低RCN3抑制肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT（上皮-间质转化）进程，并增加失巢凋亡；而过表达RCN3则产生相反的促进作用。
3.4. RCN3在体内促进RCC肺转移
动物实验显示，过表达RCN3的肾癌细胞经尾静脉注射后，在小鼠肺部形成的转移灶荧光信号更强，单位面积内的微转移灶数量也更多，证明RCN3促进RCC肺转移。
3.5. RCN3通过PI3K/Akt信号通路发挥功能
KEGG分析提示RCN3高表达与PI3K/Akt通路激活相关。Western blot证实敲低RCN3降低p-PI3K和p-Akt水平，过表达则升高其水平。使用PI3K激活剂740Y-P可挽救因RCN3敲低导致的增殖、迁移和侵袭能力下降。
3.6. RCN3与MMP10相互作用并促进其分泌
DIA-MS分析细胞上清发现，RCN3过表达导致MMP10分泌上调。IP实验证明RCN3通过其EF-hand 5/6结构域与MMP10直接相互作用。ELISA证实RCN3促进MMP10分泌，且此功能依赖EF-hand 5/6结构域。外源性重组MMP10蛋白可激活PI3K/Akt通路，并能挽救由RCN3敲低引起的恶性表型抑制。
3.7. 筛选靶向RCN3-MMP10相互作用的潜在抑制剂
通过分子对接预测RCN3与MMP10的结合界面，并进行虚拟筛选和SPR验证，研究人员从T001化合物库中鉴定出羧基-吡哆司他丁2HCl（Carboxy-pyridostatin 2HCl）。该化合物在SPR中显示高结合响应，并在Transwell实验中能显著抑制肾癌细胞的侵袭能力，且急性毒性试验显示其在20 mg/kg剂量下对小鼠无明显毒性。
四、 讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出本研究首次通过对配对样本的分析，揭示了RCN3启动子低甲基化是其在RCC肺转移中上调的原因。RCN3通过与MMP10相互作用，促进MMP10分泌，进而激活PI3K/Akt信号通路，最终驱动RCC的增殖、迁移、侵袭和肺转移。这一RCN3-MMP10轴为理解RCC肺转移提供了新的分子机制见解。此外，鉴定出的候选化合物羧基-吡哆司他丁2HCl为靶向该相互作用、抑制RCC转移提供了潜在的治疗策略。研究也承认了若干局限性，包括样本量有限、未能进行内源性Co-IP验证、以及需要未来在自发性转移模型和更多组学层面进行深入探索。
研究结论翻译如下：
总之，我们鉴定出RCN3是一个具有临床意义的肿瘤促进因子。研究首次证实启动子低甲基化导致了RCC肺转移中RCN3的上调，进而引起RCN3上调及MMP10的过度分泌。因此，RCN3可能是RCC肺转移的一个潜在治疗靶点。
