《Current Opinion in Microbiology》：Demystifying Plasmodium development within the Anopheles mosquito
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疟原虫在蚊体内的生命周期研究面临寄生虫数量瓶颈和疟原虫株差异等问题，近年通过显微镜技术、单细胞RNA测序及遗传筛选等手段，揭示了配子形成、 ookinete 侵袭中肠上皮、囊包发育及唾液腺 invasion 等关键环节的分子机制与宿主互作。
威廉·罗伯特·肖（William Robert Shaw）|弗拉米尼亚·卡特鲁奇亚（Flaminia Catteruccia）
哈佛大学陈曾熙公共卫生学院（Harvard T.H. Chan School of Public Health）免疫学与传染病系，美国马萨诸塞州波士顿
疟原虫（Plasmodium）在传播给下一个宿主之前，需要在按蚊（Anopheles）体内经历多个发育阶段。由于寄生虫数量有限以及寄生虫倍性的增加（这可能会掩盖突变表型），这些生命周期阶段的体内研究颇具挑战性。加强对这些关键寄生虫阶段的理解，有望为开发新型疟疾传播控制手段提供依据。本文旨在总结显微镜技术、单细胞RNA测序和遗传筛选方法的最新进展，这些进展彻底改变了我们对蚊子体内寄生虫发育过程（特别是孢子形成阶段）的研究。
引言
疟疾对人类的危害依然严重，2024年全球估计有61万人因此死亡，2.82亿人患病，其中94%以上发生在非洲[1]。人们已经知道，属于疟原虫属（Plasmodium）的疟疾寄生虫是通过按蚊在人与人之间传播的。然而，我们仍在探索影响传播的宿主-寄生虫相互作用的复杂机制。当雌性按蚊吸食血液时，它会摄入配子细胞，这些细胞迅速发育为配子并受精形成合子，随后经历减数分裂，18至24小时后转变为具有运动能力的动合子（ookinete）。动合子从血液中释放出来，侵入并穿过上皮细胞，在48小时内会在肠道基底表面形成卵囊（oocyst）。卵囊经过几天生长后，通过一种尚未充分研究的核分裂和细胞分裂过程产生数千个子孢子（sporozoites），完成寄生虫的孢子形成过程。释放出的子孢子会侵入唾液腺（salivary glands），随后被注入下一个人类宿主体内。
虽然已有多种模型系统（主要是啮齿动物）用于研究蚊子体内的这些复杂发育阶段，但仍然存在诸多困难。这是因为在实验室环境中培养疟原虫技术难度较大，需要温度可控的生物安全设施，且寄生虫数量存在显著瓶颈[2]；此外，这些研究通常无法反映自然传播环境中的寄生虫多重感染现象和人体免疫系统的阻断作用。不同实验室之间使用的按蚊品系（如G3，由Anopheles gambiae s.s.和Anopheles coluzzii杂交而成）及寄生虫株系NF54的感染结果也存在差异。此外，最致命的人类疟疾寄生虫恶性疟原虫（Plasmodium falciparum与标准实验室啮齿动物模型Plasmodium berghei之间存在显著生物学差异（见表1）。尽管存在这些限制，近年来显微镜技术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和遗传筛选方法的进步为深入研究蚊子体内的寄生虫发育过程提供了巨大潜力（见下文时间顺序描述）。
研究片段
通过遗传筛选确定早期寄生虫发育所需的基因
在蚊子感染初期，配子细胞从红细胞中释放出来并形成配子（n），随后融合成合子（2n），最终在血液中转变为具有运动能力的动合子（4n）。与人类无性生殖过程相比，确定对蚊子肠道内寄生虫繁殖至关重要的基因功能更具挑战性。在单倍体（n）的血液阶段，可以通过靶向突变技术（适用于恶性疟原虫（Plasmodium falciparum和Plasmodium berghei）大规模分析基因功能。
观察动合子侵入肠道上皮的过程
在血液中形成的动合子会逐步穿过肠道上皮并建立感染。它们必须突破纤维化的血块及周围形成的几丁质基质，为此会释放哺乳动物体内的纤溶酶并分泌几丁质酶来克服这些障碍[36, 37]。随后，动合子通过表面蛋白（如Pfs25、Pfs28）[38]以及分泌的黏附蛋白附着在上皮细胞表面。
深入研究动合子向卵囊的转变过程
目前关于动合子如何从上皮细胞中释放并转变为卵囊的研究较少。这一过程的难点在于寄生虫数量有限，且转变过程具有异步性，不同实验间的转变情况也各不相同，因此需要可靠的寄生虫分期指标和大量样本[3]。蚊子和寄生虫的遗传背景也会影响感染结果，例如不同实验室使用的“参考”蚊子品系（如G3，由Anopheles gambiae s.s.和Anopheles coluzzii杂交而成）及寄生虫株系NF54之间存在差异。此外，最致命的人类疟疾寄生虫恶性疟原虫（Plasmodium falciparum与标准实验室啮齿动物模型Plasmodium berghei之间存在显著生物学差异（见表1）。尽管存在这些限制，近年来显微镜技术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和遗传筛选方法的进步为研究蚊子体内的寄生虫发育过程提供了重要帮助（见下文时间顺序描述）。
结论
近年来，显微镜技术、测序方法和遗传筛选技术的进步极大地推动了我们对蚊子体内寄生虫发育过程的研究。这些方法产生了大量数据，揭示了许多此前未被充分认识的宿主-寄生虫相互作用以及寄生虫的代谢和发育机制。借助这些工具，未来的研究有望揭示更多有趣的生物学现象。
资助信息
F.C.获得了霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute, HHMI）的资助（HHMI Investigator称号），以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）的资助（项目编号：R01AI148646、R01AI153404）。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、报告撰写或文章发表决策过程。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系/个人关联：弗拉米尼亚·卡特鲁奇亚（Flaminia Catteruccia）拥有哈佛大学颁发的专利#WO2020051130A1；她还拥有一项待批准的专利#63/651,852。若存在其他作者，他们也声明自己没有可能影响研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢卡特鲁奇亚实验室的成员对手稿提供的宝贵意见。
- 20-羟基蜕皮酮（20E）
- 一种调节蚊子幼虫蜕皮和卵发育的昆虫激素
- 腺泡细胞（acinar cells）
- 唾液腺中的大型细胞，负责产生唾液成分并将其分泌到导管中
- 顶质体（apicoplast）
- 一种仅存在于顶复门（Apicomplexa）寄生虫中的细胞器，对特定细胞代谢途径至关重要；其进化起源与绿色植物中的叶绿体相关，但不具备光合作用能力
- 凋亡（apoptosis）
- 一种由多种酶协调控制的细胞死亡程序
