《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：CYP4G paralog divergence underlies pest resilience to insecticides and warming climate
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功能分化与协同适应：红面粉虫CYP4G基因亚型在热应激与杀虫剂抗性中的分子机制研究
周慧玲|冯淑艳|陈美琪|张美倩|李玉茜|李成军|李斌
南京师范大学生命科学学院，中国南京210046
摘要
理解昆虫害虫对气候变暖和杀虫剂暴露的协同适应机制对于可持续的害虫管理至关重要。本研究阐明了这种适应能力的分子基础，以世界性害虫Tribolium castaneum为例，发现CYP4G基因旁系同源物的功能分化是其中的核心机制。通过整合功能基因组学、代谢组学和表型分析，我们证明了两个旁系同源物TcCYP4G7和TcCYP4G15分别进化出了不同的特化能力，以协调实现交叉耐受性。TcCYP4G7通过上调解毒酶并同时调节氨基酸代谢来增强对拟除虫菊酯类杀虫剂的耐受性，从而增加角质层的厚度。这种双重作用不仅减少了杀虫剂的渗透，还提高了昆虫对高温的耐受性。相比之下，TcCYP4G15通过增强乙酰胆碱酯酶活性和改变角质层脂质组成来提供对有机磷类杀虫剂的保护。值得注意的是，这两种机制在热应激下都会得到增强。RNA干扰介导的这两个基因的敲低破坏了这种协同适应，导致角质层完整性受损，并重新编程了下游基因网络。我们的发现表明，CYP4G基因旁系同源物的分化支持了一种多方面的适应策略，为预测和应对复合环境压力下的害虫耐受性提供了分子框架。
引言
全球气温上升和杀虫剂的广泛使用共同施加了复杂的选择压力，推动了昆虫种群的快速进化适应（Pu等人，2019年）。越来越多的证据表明，热应激和化学应激的协同效应正在重塑害虫管理的格局。例如，气候变暖使小菜蛾（Plutella xylostella）的越冬范围在50年内扩大了240万平方公里，而在永久越冬种群中，杀虫剂抗性水平比季节性区域高出158倍（Ma等人，2021年）。同样，Anopheles stephensi和Aedes aegypti在受到热应激后再接受杀虫剂处理时，其死亡率比未受热应激的对照组低50%（Patil等人，2008年）。在分子水平上，这种协同效应归因于热休克蛋白（HSPs）和解毒酶系统在蛋白质层面的协调转录上调和功能相互作用（Mack和Attardo，2024年；Ruan等人，2024年）。然而，昆虫如何基因整合热适应和化学防御策略，特别是基因旁系同源物之间的功能分化如何使其能够应对多种环境压力，仍然是一个尚未解决的关键问题。
细胞色素P450酶是昆虫适应环境外源物质的关键酶系统，它既催化内源性化合物（蜕皮激素、信息素）的生物合成，也催化外源性物质（植物次生代谢物、杀虫剂）的解毒（Feyereisen，2020年；Nauen等人，2022年）。基因复制后的功能分化使P450家族具备了应对多种选择压力的能力。例如，在褐飞虱（Nilaparvata lugens）中，CYP6ER1基因复制后，其变体CYP6ER1vA通过新功能化获得了对两种结构无关的杀虫剂——吡虫啉和噻虫嗪的特异性代谢能力，这表明单个复制基因可以进化出多种新功能（Palli等人，2022年；Zimmer等人，2018年）。在黑凤蝶（Papilio polyxenes）中，旁系同源物CYP6B1和CYP6B3通过亚功能化实现了功能分化：CYP6B1专门代谢线性呋喃香豆素，而CYP6B3则以较低效率代谢线性和角状呋喃香豆素，从而通过互补的表达模式保持了功能冗余（Wen等人，2006年）。尽管CYP6和CYP9家族在代谢抗性中的作用已被广泛研究（Nauen等人，2022年），但其他P450亚家族（尤其是那些具有保守生理功能的亚家族）对抗性进化的贡献仍不甚清楚。
CYP4G亚家族是P450超家族中高度特化的一个分支，主要存在于新翅目昆虫中，其核心功能是催化角质层碳氢化合物（CHC）生物合成的最后一步——长链脂肪醛的氧化脱羰基反应（Feyereisen，2020年；Qiu等人，2012年）。CHC形成了一层疏水屏障，覆盖在昆虫角质层上，不仅减少了水分流失，还防止了有害物质的渗透。最近的研究表明，热应激会直接诱导CYP4G基因表达的上调，增强了CHC的合成并提高了杀虫剂耐受性（Wang等人，2024年），而在Anopheles gambiae中，通过增加29%的CHC含量和角质层厚度，杀虫剂渗透率降低了约50%（Balabanidou等人，2016年）。这些发现表明CYP4G可能通过增强角质层屏障间接促进了对热和杀虫剂的抗性。更有趣的是，尽管经历了多次基因的诞生和死亡事件，但在大多数新翅目昆虫中保留两个CYP4G旁系同源物的系统发育模式已经持续了4亿多年，这表明存在持续的选择压力维持了功能分化（Feyereisen，2020年）。来自Rhodnius prolixus的初步证据表明CYP4G106优先产生正烷烃，而CYP4G107则偏好产生甲基支链烷烃（Dulbecco等人，2020年）；在Anopheles gambiae中，CYP4G16和CYP4G17在亚细胞定位、催化效率和产物谱方面存在差异（Balabanidou等人，2016年；Kefi等人，2019年）。然而，这些旁系同源物之间功能分化的代谢基础和下游效应仍不完全清楚，它们如何协调应对热和化学应激的协同效应也完全未知。
更重要的是，CYP4G在杀虫剂抗性中的确切机制作用尚未完全阐明。一方面，CYP4G主要在脂肪体和表皮中表达，而不是在中肠等经典解毒组织中（Feyereisen，2020年；Ingham等人，2014年），迄今为止尚未有直接的体外证据证明其参与杀虫剂代谢。另一方面，抗性种群中的CYP4G基因显著上调，其过表达与抗性表型明显相关（Kim等人，2018年）。Feyereisen（Feyereisen，2020）将这种现象描述为CYP4G在“杀虫剂抗性的毒性动力学方面发挥作用”，其中角质层屏障阻碍了杀虫剂的渗透。然而，从CYP4G介导的代谢调控网络到最终抗性表型的完整分子途径仍然是一个黑箱。此外，在气候变化的背景下，只有少数研究探讨了热应激如何影响CYP4G表达和代谢物组成以调节杀虫剂敏感性（Wang等人，2024年），而分子层面的机制研究几乎不存在。这一关键的知识空白严重限制了我们在气候变化情景下预测和管理害虫抗性进化轨迹的能力。
本研究以储粮害虫红粉甲虫（Tribolium castaneum）作为模式生物，其基因组中仅包含两个CYP4G旁系同源基因TcCYP4G7和TcCYP4G15，它们是T. castaneum中CHC生物合成的终端酶。本研究系统地研究了CYP4G旁系同源基因在环境应激适应和杀虫剂抗性调节中的功能分化机制。我们采用了一种综合方法，结合RNA干扰介导的基因敲低、代谢组学分析和表型测定，来区分这两个TcCYP4G基因在角质层化合物生物合成、杀虫剂抗性和热适应中的作用。我们的发现揭示了这两个基因在时空表达模式、代谢途径特异性和抗性机制效应方面的显著差异。此外，高温应激分别增强了它们对λ-氰氯氰菊酯和毒死蜱的抗性水平。这些发现不仅阐明了TcCYP4G基因功能分化的分子机制，还为理解气候变化背景下的害虫抗性进化提供了分子框架，并为开发基于精准的、适应气候的综合性害虫管理策略提供了理论基础和潜在的分子靶点。
部分摘录
昆虫品系
野生型（WT）T. castaneum Georgia-1（GA-1）品系对杀虫剂敏感，被保存在气候控制的培养箱（Percival，美国）中，条件如下：温度30 ± 1°C，相对湿度40 ± 5%，光照周期14小时：10小时（L:D）。昆虫的饮食由小麦粉和酵母粉按19:1的比例混合而成（Zhou等人，2025年）。
RNA提取和逆转录
使用Trijol试剂盒（CWBIO，上海，中国）从以下样本中提取总RNA，
序列分析和系统发育树构建
TcCYP4G7的开放阅读框（ORF）长度为1662 bp，编码553个氨基酸，而TcCYP4G15的ORF长度为1683 bp，编码560个氨基酸。这两种蛋白质都含有细胞色素P450超家族的特征保守结构域（图S1A）。TcCYP4G7和TcCYP4G15都是亲水性蛋白质，GRAVY值分别为-0.227和-0.284。TcCYP4G7的预测分子量为63.65 kDa，理论等电点（pI）为8.32，而TcCYP4G15的
讨论
本研究通过整合功能基因组学、代谢组学和表型分析，系统阐明了T. castaneum在热-杀虫剂协同适应过程中CYP4G旁系同源物的功能分化机制。我们的发现表明，TcCYP4G7和TcCYP4G15通过不同机制的差异调节来介导对不同杀虫剂的特异性抗性，并且这种抗性在热应激下显著增强。这些发现提供了新的
CRediT作者贡献声明
李玉茜：研究、正式分析。李成军：资源获取、概念构思。陈美琪：验证、软件使用。张美倩：方法学、正式分析。周慧玲：写作——初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念构思。冯淑艳：验证、软件使用、方法学、数据管理。李斌：写作——审稿与编辑、项目监督、资金获取、概念构思
数据可用性
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资助声明
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32470528和32170521）的财政支持。
