URP70–1是一种来自Uncaria rhynchophylla根部的新型多糖，它通过调控GRP78/CHOP-ERK-Bax/Bcl-2通路诱导细胞凋亡

《International Journal of Biological Macromolecules》：URP70–1, a novel polysaccharide from the roots of Uncaria rhynchophylla induced apoptosis by regulating GRP78/CHOP-ERK-Bax/Bcl-2 pathway

本研究从金丝藤中分离并鉴定了新型多糖URP70–1，结构分析表明其由阿拉伯糖、半乳糖和木糖组成。体外实验显示URP70–1抑制结肠癌细胞增殖、迁移及凋亡；体内实验证实其通过内质网应激和ROS/ERK/p38信号通路抑制肿瘤生长且无毒性。为开发抗肿瘤药物奠定基础。

　　

吴中南|李俊豪|徐小龙|董国通|焦玉坤|张少杰

中国广东省东莞市广东医科大学药学院天然药物研发重点实验室附属东莞松山湖中心医院，523808

摘要

来自药用植物的多糖因其潜在的抗肿瘤特性和良好的安全性而受到广泛关注。在本研究中，从Uncaria rhynchophylla中分离出一种具有抗肿瘤活性的新型多糖，命名为URP70–1。结构分析表明，URP70–1是一种新型的8.2 kDa多糖，由L-阿拉伯糖（52.8%）、D-半乳糖（35.4%）和D-木糖（11.8%）组成。甲基化和核磁共振（NMR）光谱分析进一步阐明了其一级结构，该多糖的主链由→3,5)-L-Araf-(1→, →4)-D-Galp-(1→, 和 →2,5)-L-Araf-(1→)残基构成，侧链包含→3)-L-Araf-(1→, →5)-L-Araf-(1→, →6)-D-Galp-(1→, L-Araf-(1→, D-Xylp-(1→, 和 D-Galp-(1→)残基。使用斑马鱼异种移植模型进行的体内实验表明，URP70–1以剂量依赖的方式显著抑制了肿瘤增殖，且未观察到毒性。在CT26结肠癌细胞上的体外研究表明，URP70–1降低了细胞活力和迁移能力，增加了细胞内活性氧（ROS）水平，并降低了线粒体膜电位，最终促进了细胞凋亡。机制研究表明，URP70–1通过GRP78-EIF2S1-CHOP途径进入细胞并诱导内质网应激，同时激活ROS/ERK/p38信号通路，导致线粒体功能障碍、Bax/Bcl-2比值升高、细胞色素C释放以及caspase级联反应的激活。这些发现表明URP70–1是一种结构新颖的多糖，通过内质网应激和线粒体凋亡途径发挥强大的抗肿瘤作用，为其作为潜在的结肠癌治疗剂的发展奠定了基础。

引言

Uncaria rhynchophylla（Miq.）属于茜草科[1]，是一种传统药用植物，主要分布在中国贵州、广西和广东等省份[2]。几个世纪以来，U. rhynchophylla被广泛用于治疗心血管和神经系统疾病，包括高血压、头晕、抽搐和癫痫[3]。现代药理学研究将其治疗效果归因于多种生物活性化合物，如生物碱、黄酮类、三萜类和多糖[3]。其中，rhynchophylline和isorhynchophylline等生物碱因其神经保护和降压作用而被广泛研究[4]。然而，尽管人们对植物多糖在生物医学应用中的兴趣日益增加，U. rhynchophylla多糖（URPs）作为抗肿瘤剂的潜力仍很大程度上未被探索[5]。 多糖作为由单糖单元组成的天然生物聚合物，由于其显著的生物活性、低毒性和良好的生物相容性，在生物医学领域引起了广泛的研究兴趣[5]。许多植物来源的多糖表现出良好的抗肿瘤特性[6]。例如，从Bupleurum chinense中提取的多糖（BCP）通过细胞周期S期停滞和诱导凋亡来抑制H22肿瘤的增殖[7]。黄芪多糖（APS）通过下调RNA甲基转移酶METTL3来抑制乳腺癌进展，从而减少N6-甲基腺苷（m6A）修饰和致癌基因MAL2的表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[8]。一种新型人参多糖（GP-A）通过激活巨噬细胞和增强细胞因子分泌（通过PI3K/AKT信号通路）表现出强大的免疫调节作用，从而提高宿主的抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤细胞增殖[9]。这些药物通常通过直接杀伤恶性细胞、触发凋亡途径、抑制转移过程和调节肿瘤微环境来发挥治疗效果[6]。由于传统化疗存在严重的不良反应和药物耐药性问题[10]，开发创新的多糖来源抗肿瘤剂成为一种非常有前景的治疗策略。 尽管对U. rhynchophylla中的生物碱成分进行了大量研究，但其多糖成分的研究仍然相对较少。现有文献证实该植物中存在水溶性多糖[11]，但对其药理活性的详细结构解析和系统研究，特别是其抗肿瘤效果仍缺乏。在我们小组的初步工作中，我们已经报道了从该植物中分离出的两种多糖（URP90–1和URP90–3）的结构特征及其免疫调节活性[12]。然而，关于这些多糖抗肿瘤药效学基础的研究仍然有限。这一知识空白严重阻碍了URPs作为潜在治疗剂的进一步开发和应用。 因此，本研究成功分离并结构表征了从U. rhynchophylla根中提取的一种新型多糖（URP70–1），并评估了其抗肿瘤潜力。研究在两个层面进行：结构上，通过系统提取和纯化获得了URP70–1，并使用HPGPC、GC–MS、甲基化分析、NMR和Congo red检测等技术全面阐明了其分子量、单糖组成、糖苷连接模式和空间构象；在生物活性和机制方面，首先使用斑马鱼异种移植模型确认了URP70–1的体内抗肿瘤活性和生物安全性。随后，结合CT26结肠癌细胞模型、MTT检测、伤口愈合检测、流式细胞术、ROS和JC-1荧光检测以及Western blot，阐明了其分子机制：URP70–1通过GRP78-EIF2S1-CHOP途径诱导内质网应激，并激活ROS/ERK/p38信号通路，从而调节Bax/Bcl-2平衡并触发线粒体介导的凋亡。这些发现为将URP70–1开发为抗肿瘤药物奠定了基础，并扩展了URPs相关领域的研究视野。

材料与试剂

U. rhynchophylla根材来自中国贵州剑河县，并由广东医科大学的Chong Yan博士进行了鉴定。关于实验材料和试剂的详细信息见补充方法S1。

U. Rhynchophylla多糖（URP70–1）的制备

通过水提取和乙醇沉淀法获得了U. rhynchophylla中的粗多糖（UR70），随后使用蒸馏水作为洗脱液，通过DEAE-FF阴离子交换色谱法进行了纯化。

URP70–1的均匀性和分子量分析

图1A展示了URP70–1的分步分离和纯化过程。简要来说，粗多糖UR70是通过热水提取结合乙醇沉淀法制备的。随后，UR70经过DEAE-FF阴离子交换色谱法处理，用蒸馏水洗脱得到的组分被命名为URP70–1（图1B）。最后使用Sephadex G-75柱进行尺寸排阻色谱纯化，得到了纯化的多糖。

结论

本研究从U. rhynchophylla根中分离并表征了一种新型多糖URP70–1。结构分析证实了其独特的单糖组成和连接模式。URP70–1在体外和体内均表现出显著的抗肿瘤活性。在斑马鱼异种移植模型中，URP70–1以剂量依赖的方式有效抑制了肿瘤生长，且未引起毒性。在CT26结肠癌细胞中，URP70–1抑制了细胞的增殖和迁移。

CRediT作者贡献声明

吴中南：撰写初稿、软件使用、方法设计、实验实施、数据管理。李俊豪：撰写初稿、软件使用、方法设计、实验实施、数据管理。徐小龙：数据管理、项目协调、软件使用、撰写审核与编辑。董国通：软件使用、结果验证。焦玉坤：项目协调、监督、结果验证。张少杰：撰写审核与编辑、项目协调、方法设计、资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（批准号：82304697）、广东省基础与应用基础研究基金（批准号：2024A1515012208）、人才引进科学研究基金（QD-2024004B）、山东省自然科学基金（批准号：2024TSGC0584）、广东省普通高校特色创新项目（批准号：2024KTSCX167）以及临床专项等机构的财政支持。