壳聚糖、西瓜果肉中的番茄红素以及氧化锌纳米粒子的结合：一种具有抗癌和抗菌特性的绿色纳米复合材料

《International Journal of Biological Macromolecules》：Integration of chitosan, watermelon pulp lycopene, and zinc oxide nanoparticles: A green nanocomposite with anticancer and antimicrobial potential

采用水瓜皮介导的绿色两步法合成了壳聚糖和水瓜果肉提取物功能化的ZnO纳米颗粒（WRZCLNPs），其结构经光谱和显微分析验证，展现出选择性抗癌活性（IC50分别为40.96和38.87 μg/mL）和浓度依赖性抗菌活性（MIC 250-495 μg/mL），机制涉及ROS积累、线粒体 depolarization及PI3K/Akt通路抑制。

　　

Nouf M. Al-Enazi

沙特阿拉伯阿尔卡赫吉萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹大学科学与人文学院生物系，邮编11942

摘要

采用了一种两步绿色合成方法，结合果皮介导的ZnO形成过程和富含壳聚糖及番茄红素的果肉提取物涂层，制备了壳聚糖和西瓜提取物功能化的ZnO纳米颗粒（WRZCLNPs）。光谱和显微镜分析证实了这些颗粒具有结晶状的ZnO核心和无定形的有机外壳，这一结论得到了紫外-可见光谱（UV–Vis）变化、X射线衍射（XRD）结果、傅里叶变换红外光谱（FTIR）特征、X射线光电子能谱（XPS）数据以及透射电子显微镜（TEM）观察结果的支持。涂层后，颗粒聚集体变得更加均匀致密；能量分散分析（EDX）显示碳和氮含量增加，这与壳聚糖和提取物的掺入一致。动态光散射实验表明，WRZCLNPs的多分散性（PDI）低于未涂层ZnO（PDI为57.58），且其ζ电位接近中性。WRZCLNPs对MCF-7和HT-29细胞表现出选择性细胞毒性，半数杀伤浓度（IC??）分别为40.96 μg/mL（95%置信区间：38.13–44.25）和38.87 μg/mL（95%置信区间：36.53–41.37），而正常细胞系的存活率仍超过90%。机制研究显示，WRZCLNPs能诱导ROS生成、线粒体去极化、细胞周期停滞（G2/M期）、DNA断裂及细胞凋亡，并伴随PI3K和pAkt/Akt水平的降低。此外，WRZCLNPs还表现出浓度依赖性的抗菌活性，最小抑菌浓度（MIC）在250至495 μg/mL之间。这些发现揭示了一种可持续的“果皮到核心”和“果肉到外壳”的策略，用于制备具有双重抗癌和抗菌潜能的多功能纳米复合材料，为进一步的临床前评估提供了基础。

引言

西瓜（Citrullus lanatus）是一种经济价值高的水果，富含水分和营养成分。近年来，人们对其关注点从食用价值转向了其丰富的植物化学成分和潜在的治疗作用[1]、[2]、[3]、[4]。西瓜的果肉和果皮都含有多种生物活性代谢物，包括类胡萝卜素、黄酮类、酚酸、单宁、甾醇和必需脂肪酸[3]、[4]。其中，番茄红素是主要的类胡萝卜素，对西瓜的抗氧化和健康促进作用起着关键作用。其他重要成分还包括β-胡萝卜素、植烯和多种黄酮醇[3]、[4]。研究表明，西瓜提取物具有抗氧化、保护肝脏、抗糖尿病和抗癌作用，这表明其在营养保健和药物开发方面具有巨大潜力[4]、[5]、[6]。值得注意的是，通常被作为农业废弃物丢弃的西瓜果皮是多酚和还原糖的丰富来源，可将其作为合成绿色纳米颗粒（NPs）的可持续原料[4]。

纳米技术已成为提升治疗分子性能的重要工具。纳米颗粒能够改善药物的溶解性、稳定性、吸收效果及细胞摄取能力，同时实现可控和靶向递送[7]、[8]。在金属氧化物纳米材料中，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因独特的物理化学性质、广谱生物活性及良好的安全性而备受关注[9]。ZnO NPs具有光催化和半导体特性，能生成活性氧（ROS）[10]、[11]，这些特性是其生物活性的基础，例如它们能诱导癌细胞发生氧化应激[10]、[12]。部分研究还指出，ZnO NPs对正常细胞的毒性较低[13]、[14]。此外，ZnO NPs通过破坏微生物膜、结合蛋白质及干扰DNA发挥广谱抗菌作用[15]、[16]、[17]。

尽管具有这些优势，裸露的ZnO NPs容易聚集，从而影响其稳定性并限制其在生物医学领域的应用[18]。表面修饰是克服这些问题的常用方法。壳聚糖是一种从甲壳素中提取的天然阳离子多糖，常被用作涂层和稳定剂[19]，它能增强纳米颗粒的分散性、提供空间保护并提高生物相容性[20]、[21]。壳聚糖的氨基和羟基还可进一步进行化学修饰[22]。值得注意的是，壳聚糖本身也具有生物活性[23]，它可以与带负电荷的细菌膜相互作用，增加膜的通透性并导致细胞死亡[24]。当用于ZnO NPs的涂层时，壳聚糖不仅能防止颗粒聚集，还能提供额外的抗菌效果[25]、[26]。其pH响应性溶解特性使其特别适合药物递送，因为它能在酸性环境（如肿瘤组织或感染部位）促进封装化合物的释放[22]。

番茄红素是西瓜中的主要生物活性成分，是一种强效抗氧化剂。其长链共轭双键结构使其能高效吸收单线态氧并迅速失活，使其在清除单线态氧方面比许多其他类胡萝卜素更有效[27]。大量摄入番茄红素可降低前列腺癌、乳腺癌和胃肠道癌症的风险[28]、[29]。机制研究表明，番茄红素能干扰信号通路（PI3K/Akt、MAPK和NF-κB），从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡并抑制血管生成[30]、[31]。它还能保护组织免受氧化和炎症损伤[32]。然而，由于番茄红素在水中的溶解度低、在氧化条件下不稳定以及生物利用度差，其应用受到限制[33]。将其封装在纳米颗粒中可以克服这些缺点，保护其免受降解、提高溶解度并实现持续释放[34]、[35]。

多项先前的研究支持将生物活性分子与壳聚糖稳定的纳米颗粒结合使用的策略。例如，溶解度较低的化疗药物紫杉醇已成功装载到壳聚糖包覆的ZnO纳米载体中[22]。多柔比星和姜黄素等药物也通过壳聚糖基纳米颗粒实现递送[36]、[37]，这些系统提高了药物的稳定性、控制了释放过程、增强了肿瘤靶向性和抗菌效果。这些研究凸显了壳聚糖基纳米载体在抗癌和抗菌应用中的多功能性。

本研究旨在制备并评估一种多功能纳米系统，该系统整合了三种生物活性成分：ZnO NPs、壳聚糖涂层以及富含番茄红素的西瓜提取物（WMLRE）。ZnO具有天然的抗癌和抗菌活性，壳聚糖提高了稳定性并增强了药物吸收，而番茄红素则增强了化学预防效果。通过这些成分的协同作用，预期该纳米系统能诱导癌细胞凋亡、调节细胞生存通路并抑制病原菌生长。

化学物质和细胞系

荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H?DCFDA）、吖啶橙（AO）、溴化乙锭（EtBr）和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）由Invitrogen（美国卡尔斯巴德）提供。用于检测线粒体膜电位（MMP）的试剂盒、碘化丙啶（PI）以及Bcl-2-PE（目录号340576）和裂解的caspase-3-FITC（目录号559341）抗体来自BD Biosciences和BD Pharmingen。其他抗体Bax-AF647（目录号7480）也用于实验。

WMLRE的植物化学特性

WMLRE的紫外-可见光谱如图S1A所示。在445、470和500 nm处出现的吸收峰证实了其中含有番茄红素，而283 nm处的峰表明提取物中还含有其他酚类化合物。WMLRE的傅里叶变换红外光谱（FTIR）图S1B显示了典型的植物次级代谢物官能团。3392.14 cm?1处的宽吸收峰对应于O-H键的伸缩振动，2922.23和2852.70 cm?1处的峰则表明存在脂肪族C-H键的伸缩振动。

WMLRE的植物化学特性

对WMLRE的植物化学分析显示，除了番茄红素外，其中还含有多种其他植物化学成分，包括类胡萝卜素、黄酮类、酚酸、甾醇和萜类化合物[1]、[2]、[3]、[4]、[39]、[40]。液相色谱-质谱（LC–MS/MS）分析鉴定出了植烯、echinenone和β-胡萝卜素等类胡萝卜素，以及galangin、scutellarein衍生物、medicarpin葡萄糖苷和isorhamnetin葡萄糖苷等黄酮类化合物[39]、[40]、[41]。

结论

本研究提出了一种简单的“果皮到核心”和“果肉到外壳”的策略来制备WRZCLNPs：西瓜果皮促进ZnO的形成，而富含番茄红素的果肉提取物和壳聚糖则构成了外层有机涂层。物理化学表征证实了WMLRE具有结晶状的ZnO核心和富含植物化学物质的有机外壳：XRD结果显示ZnO具有纤锌矿结构；涂层后出现了更多的无定形成分；FTIR谱线显示了O-H键、C-O/C-O-C等官能团的特征。

CRediT作者贡献声明

Nouf M. Al-Enazi： 负责撰写初稿、监督研究、获取资金及概念构思。

利益冲突声明

作者声明她没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹大学通过项目编号（PSAU/2024/01/31666）资助了这项研究工作。同时，作者衷心感谢印度泰米尔纳德邦塞勒姆的Bioinnov Solutions LLP和生命科学研发中心提供的样品分析设施。