内生真菌Chitinophaga pinensis的形态可塑性

《Antonie van Leeuwenhoek》：Morphological plasticity of endophytic Chitinophaga pinensis

　　**摘要**

环境变化，无论是由于气候变化还是人为影响，都会削弱植物对生物和非生物压力的抵抗力，例如病原体、干旱和高温。已知植物微生物群可以促进植物的抵抗力。为了能够利用植物微生物组的潜力，我们需要识别具有保健特性的微生物群。最近的研究表明，细菌Chitinophaga pinensis能够增强植物健康并提高其对真菌感染的抵抗力。在这里，我们展示了C. pinensis表现出异常高的形态可塑性，可以在丝状细胞状态和球形细胞状态之间切换，每种状态都有独特的转录谱特征。尽管存在这些转录差异，球形细胞仍然保持代谢活跃并进行复制，同时缺乏通常与休眠状态相关的结构特征。此外，C. pinensis的球形细胞形态通过表面活性剂“欺骗”行为促进了其移动能力，这可能影响其在植物微生物组中的传播和相互作用。为了研究这种内生植物的结构动态和转录适应，我们结合使用了显微镜和培养技术。总的来说，我们的研究为这种有益于植物的C. pinensis的形态灵活性和转录调控提供了新的见解。

**引言**

现代农业日益面临气候变化和世界人口增长的挑战。因此，必须开发新的措施和创新策略来保护资源并尽量减少损失，以确保可持续的未来。其中一种策略是理解和利用植物的自然防御和抵抗机制。许多研究已经表明，植物微生物群在这方面起着决定性作用（参考文献Trivedi等人2020年；Pan等人2023年；Spooren等人2024年）。植物及其相关的微生物群通常被称为全生物体，因为它们参与复杂的共生相互作用，并且作为一个群体拥有进化历史（参考文献Vandenkoornhuyse等人2015年）。在植物微生物群中，Bacteroidetes门尤为突出，因为它包含许多与多种宿主相关的共生菌株（Pérez-Jaramillo等人2018年；Hildebrand等人2021年）。这些微生物可以直接通过促进植物健康来增强宿主的适应性，或者间接通过支持微生物群中的其他成员来发挥作用。那些在植物组织中定植而不造成伤害或负面影响宿主的微生物被称为内生菌。最近的研究表明，内生菌株Flavobacterium anhuiense和Chitinophaga pinensis有助于植物健康并提高其抗逆性（Carrión等人2019年）。与植物相关的微生物群的多样性反映了多种可以增强植物抵抗力的策略。其中一种策略是“求救”反应，即植物在环境压力下通过释放根际分泌物来主动招募有益微生物。这些分泌物的组成取决于压力条件，这导致已经存在于微生物群中的细菌发生特定的代谢适应，并刺激次生代谢产物的产生（Rolfe等人2019年；Liu等人2021年、2024年；Spooren等人2024年）。然而，诱导的抗逆效果取决于微生物群的组成，缺少关键成员会降低响应效果（Salas-González等人2021年）。在植物病原体存在的情况下，这种效应在激活的防御机制中更为明显（Matsumoto等人2021年；Liu等人2024年）。为了优化微生物群的组成以自然保护植物，识别关键的微生物组成员并了解参与其招募的因素非常重要。如上所述，植物会分泌根际分泌物来根据需要主动招募和塑造其微生物群（Liu等人2021年）。这些分泌物包含多种化合物，包括糖类、氨基酸、酶、脂肪酸和多酚类物质如黄酮类化合物（Vives-Peris等人2020年）。为了成功定植于根际和内生环境中，微生物必须能够检测并响应这些信号。许多运动型细菌通过趋化性实现这一点，使它们能够通过调节鞭毛马达的化学感应途径感知并沿着化学梯度移动（Briegel等人2014年；Yang和Briegel 2020年）。根据它们的结构适应性，细菌利用不同的运动策略，包括鞭毛驱动的游泳和群集或滑动运动，后者依赖于表面黏附素（Shrivastava和Berg 2015年；Mattingly等人2018年）。然而，有些细菌不具备趋化性结构或运动机制。这就提出了一个问题：这些菌株是如何到达植物并在微生物组中建立自己的？先前的研究表明，非运动型内生链霉菌孢子可以由运动型细菌运输，这一过程被称为“搭便车”（Muok等人2021年）。搭便车允许非运动型细菌在不消耗自身能量的情况下受益于趋化性运动，可能在宿主定植中提供生态优势。正如Muok等人（2021年）和Seymour等人（2024年）所提出的，搭便车也可以为细菌群落带来长期利益，有助于它们通过障碍物移动并促进代谢交换。在这里，我们重点关注Chitinophaga pinensis，它最近被认为是在抵抗病原体和抗逆性方面重要的植物微生物群成员（Carrión等人2019年）。C. pinensis最初是从松树落叶中分离出来的，是一种革兰氏阴性细菌，存在于包括作物在内的多种植物的内生环境中（Carrión等人2019年）。它以其分解复杂多糖（如几丁质）和产生多种生物活性分子的能力而闻名，这突显了其在农业和工业应用中的潜在价值（Brinkmann等人2022年）。此外，先前的研究报告称C. pinensis形成所谓的黏孢子或微囊，这些被假设为类似于细菌孢子的休眠阶段（Sangkhobol和Skerman 1981年；Reichenbach 1992年；Glavina Del Rio等人2010年）。然而，这些结构主要是基于它们在光学显微镜下的球形形态来描述的，其代谢状态尚不清楚。虽然大多数关于C. pinensis的研究仅关注其代谢能力，但在本研究中，我们使用微生物学检测、冷冻电子显微镜和转录组学相结合的方法研究了细胞的超微结构以及它们在全生物体中的相互作用。特别是，我们旨在了解C. pinensis的形态是否取决于生长条件，以及这如何与其与植物组织的相互作用能力相关。此外，我们还试图确定这些相互作用是否仅基于化学信号，或者物理结构（如外膜囊泡（Kaplan等人2021年）在与植物的通讯中起作用。值得注意的是，Carrión（2019年）研究的C. pinensis菌株既不具有运动性也不具备趋化性结构，这引发了关于其在全生物体中的招募和生态角色的疑问。最后，我们研究了C. pinensis的这些特性如何贡献于其生态功能及其对植物微生物组动态的潜在影响。

**结果**

**Chitinophaga pinensis展现出两种不同的细胞形态**

为了更好地了解C. pinensis随时间的变化形态，我们通过光学显微镜在不同培养时间下观察了细胞培养。在新鲜培养物中，生长20小时以内，细胞是丝状的，长度可达40微米（如先前所述（Sangkhobol和Skerman 1981年）。有趣的是，在生长20到40小时之间，C. pinensis的形态从几微米长的丝状细胞显著转变为直径为600–700纳米的小球形细胞（图1A）。当转移到细胞密度较低的新鲜培养基中时，球形细胞恢复到了丝状细胞状态（在线资源1）。为了更详细地了解这两种细胞形态，我们使用了冷冻电子断层扫描（cryo-ET）。这两种细胞类型都被典型的革兰氏阴性细胞膜包裹，内含有均匀分布的核糖体和其他细胞内容物。这两种细胞类型都不类似于先前描述的孢子或囊泡，例如具有更厚的保护性细胞膜（图1A）。

**C. pinensis形态类型的形态可塑性和抗逆性**

A. 细胞通过光学显微镜（AI–II；刻度尺10微米）和冷冻电子断层扫描（AIII–IV；刻度尺100纳米）成像。（AI）培养20小时后的长丝状细胞和培养40小时后的小球形细胞。（B）化学应力测试：在添加了逐渐增加的乙醇浓度或改变pH值的0.1×TSB培养基中测试了两种形态的抵抗行为。测量了20小时内的OD600变化，并显示了基于95%置信区间的计算生长参数：倍增时间（BI）和承载能力（BII）（N=3）。

为了更好地可视化C. pinensis从丝状生长到球形生长的形态切换，我们试图将GFP引入细菌中。GFP标记的设计目的是实现活细胞成像和精确跟踪形态变化，特别是因为球形细胞非常小（600–700纳米），使得在显微镜下难以聚焦和区分其他颗粒或碎片。因此，将编码GFPmut3的基因在其天然gap启动子控制下克隆到pCP23中（材料和方法部分有详细说明），pCP23是Flavobacteria和E. coli之间的穿梭载体。所得构建体pGWS1802通过电穿孔成功引入。然而，质粒未能稳定维持：绿色荧光随着每一代细菌的繁殖而减弱。这表明质粒在C. pinensis中未能复制，很可能是因为pCP23上的repB复制起点与Flavobacteria不兼容，因此在该物种中无法有效发挥作用。

**细胞形态对物理和化学应力的抵抗谱**

长时间生长后观察到的小球形细胞与之前的报道一致，这些报道将它们描述为微囊或孢子。然而，我们的冷冻电子断层扫描结果揭示，小球形细胞形式没有典型的孢子形态，如增厚的细胞膜和紧密堆积的细胞内容物。因此，我们想知道这两种细胞形态是否对各种物理和化学应力因素表现出不同的反应。两种细胞形态对以下应力因素表现出相似的抵抗力：10分钟的紫外线照射、60°C的热应激和最多5分钟的超声波处理。两种C. pinensis细胞形态在脱水后都能存活，并且可以通过接种到新鲜培养基上复活。对脱水后的C. pinensis细胞进行光学显微镜检查显示，无论初始形态如何，都是小球形细胞。进一步的化学应力测试显示，两种细胞形态在pH值变化和存在最多0.2%乙醇的情况下抵抗行为略有不同（图1B）。然而，在2%乙醇存在下，两种细胞形态的生长都减少了。C. pinensis的两种细胞形态在含有SDS（0.02–2%）的培养基中都无法生长。

总体而言，与丝状细胞形态相比，球形形态表现出更高的OD600基础承载能力和稍短的倍增时间（图1B）。尽管如此，两种形态之间的抵抗谱差异很小。

接下来，我们研究了细胞大小的减小和小球形细胞的形成是否代表一种应激反应。为此，我们分析了在盐（0.5–2%）或氯霉素（12.5–100 μg/ml）存在下的生长情况。当具有丝状表型的细胞暴露于更高的盐度和氯霉素浓度时，观察到了细胞长度的减少（在线资源2）。随着盐分和氯霉素浓度的增加，球形细胞在培养物中的比例比对照条件下的增长速度更快（在线资源2）。无论培养基中的盐分和氯霉素浓度如何，所有培养物在培养2天后都会出现球形细胞。对20小时和40小时培养物的转录组分析表明，球形细胞之前被认为是休眠孢子。然而，这里展示的冷冻电镜（cryo-EM）和抗性测试并未发现与休眠相关的典型结构和生理特征。为了评估这两个时间点及相应培养类型之间的转录模式变化，我们对培养20小时和40小时后的RNA进行了转录组分析。在RNA提取前的显微镜检查确认，20小时和40小时的样本主要呈现丝状和球形形态。尽管不能完全排除少数其他形态的细胞存在，但样本明显以预期的细胞类型为主，因此残余的丝状细胞不太可能是导致观察到的转录特征的原因。所有培养物都在相同的条件下进行培养（1.0×TSB，25°C，250转/分钟）（在线资源1）。在线资源3中显示的生长曲线是在培养20小时和40小时后采集细胞，调整到相同的OD600值后重新接种到新鲜培养基中得到的。在两个采样时间点（20小时和40小时），摇瓶培养物的OD600仍在增加，表明培养物尚未达到完全稳定的状态。尝试通过计数菌落形成单位（CFU）来量化生长没有成功，因为早期菌落太小而无法可靠检测到，而后期菌落的融合又阻碍了精确计数。

主成分分析（PCA）清楚地显示了两个时间点之间的转录差异（在线资源4）。差异表达基因（DEGs）定义为变化倍数≥2（FC≥2）且调整后的p值（padj）为0.05。根据这些标准，在40小时样本中，有691个基因上调，615个基因下调，总共6094个基因（在线资源5）。上调和下调的DEGs列表以及所有DEGs都接受了KEGG通路富集分析（表1）。在40小时下调的基因显著富集了核糖体成分（cpi03010），而在上调基因中氨基酸生物合成基因（cpi01230）的代表性明显较低。此外，参与果糖和甘露糖代谢（cpi00051）以及脂肪酸生物合成（cpi00061）的基因也主要下调。在脂肪酸生物合成通路中，识别出的大多数基因（25个中的19个）表达减少，表明该通路发生了广泛的转录变化。尽管在40小时下调了参与翻译和生物合成过程的基因，但在对照条件下重新接种后的生长测量显示两个时间点的生长动态相当。在20小时时，倍增时间为1.53小时（μ=0.45 h?1，95% CI：1.32–1.83），在40小时时为1.62小时（μ=0.43 h?1，95% CI：1.39–1.94），置信区间重叠。Welch t检验比较20小时和40小时对照组的生长参数没有显著差异（p=0.350；95% CI：-0.359–0.834）。

接下来，我们试图确定特定培养条件是否会影响观察到的形态变化的程度或速度。为此，我们系统地改变了（i）细胞密度（OD600=0.2和0.5），（ii）营养含量，以及（iii）条件培养基中的成分，使用了五种不同的培养基：新鲜培养基（0.1×TSB；FM）、丝状细胞的旧培养基（LM）、球形细胞的旧培养基（SM）、添加了新鲜培养基的SM（SMT）和磷酸盐缓冲盐水（PBS；B）。由于这些因素相互关联，我们通过调整它们在培养基中的浓度来进行测试。

在FM、LM和SMT培养基中，总体趋势是丝状细胞的细胞长度减少了大约29%，而球形细胞的细胞长度增加了约74%（图2）。

在不同培养条件下，我们接着研究特定培养条件是否会影响观察到的形态变化的程度或速度。为此，我们系统地改变了（i）细胞密度（OD600=0.2和0.5），（ii）营养成分，以及（iii）条件培养基中的成分，使用了五种不同的培养基：新鲜培养基（FM）、丝状细胞的旧培养基（LM）、球形细胞的旧培养基（SM）、添加了新鲜培养基的SM（SMT）和磷酸盐缓冲盐水（PBS；B）。由于这些因素相互关联，我们通过调整它们在培养基中的浓度来进行测试。

在FM、LM和SMT培养基中，总体趋势是丝状细胞的细胞长度减少了大约29%，而球形细胞的细胞长度增加了约74%（图2）。

对于这两种形态的细胞，与初始值相比，3小时后都观察到了可测量的细胞长度变化，且密度相关的差异变得明显。6小时后，这些差异减小，每种细胞形态的细胞长度显示出趋同的趋势（图2）。

细胞密度的影响在丝状细胞中比在球形细胞中更为明显。在球形细胞中，两种密度都导致了相似的长度增加，主要区别在于增加的速度。相比之下，丝状细胞根据初始密度显示出不同的模式：在高密度（0.5）下，6小时后细胞长度连续减少了约32%，而在低密度（0.2）下，3小时后细胞长度最初减少了45%，随后6小时后增加了约27%。这种总体模式在FM、LM和SMT培养基中都是一致的。在B和SM培养基中观察到了偏离这种总体模式的情况：在B培养基中，较高细胞密度（0.5）下，丝状细胞的长度随时间增加了约6%（图2B）；而在SM培养基中，较低细胞密度（0.2）下，6小时后丝状细胞的长度继续减少（约48%）（图2C）。

在实验过程中，我们假设培养基中的营养成分从高到低的顺序依次减少：SMT > FM > LM > SM > B。其中假设B培养基不含营养成分或潜在的细胞外因子。我们还假设LM含有来自丝状细胞的细胞外因子，而SM和SMT含有来自球形细胞的细胞外因子。

总的来说，在所有测试条件下，两种细胞形态都观察到了细胞长度的变化。详细信息和每种条件的单独图表在补充材料中提供（在线资源6）。

基于我们观察到C. pinensis在测试条件下不具运动性（在线资源7）并表现出形态可塑性，接下来我们研究了球形细胞是否具有适应性优势，特别是在它们能否利用运动细菌进行“搭便车”的能力方面。为此，我们重复了Muok等人（2021）的搭便车实验，以确定C. pinensis两种细胞形态的搭便车能力。为此，我们分离出C. pinensis的球形细胞并将其放置在半固体培养基平板上，上面覆盖有B. subtilis。通过观察黄色菌落的扩散来评估C. pinensis细胞的搭便车行为。

如图3A(III)所示，当加入球形细胞时，黄色菌落会在平板上扩散。

图3

C. pinensis和Bacillus subtilis之间的运动性和搭便车相互作用。（AI）单独培养的C. pinensis在测试条件下不表现出运动性，其黄色菌落停留在接种点。（AII）单独培养的运动型B. subtilis野生型菌株（WT；NCIB3610）表现出表面扩散。（AIII）当球形C. pinensis细胞与运动型B. subtilis野生型菌株（WT；NCIB3610）结合时，黄色菌落在平板上扩散。（B）表面活性物质的利用和集体移动。（BI）进一步的测试表明，C. pinensis可以利用来自B. subtilis的外部提供的表面活性物质。（BII）然而，在B. subtilis存在的情况下，使用初始为球形的C. pinensis细胞时，黄色菌落跟随B. subtilis菌落的集体移动。（BIII）冷冻电镜成像揭示了两种生物之间的相互作用：黑色箭头表示B. subtilis的鞭毛，黑色X标记表示C. pinensis，白色三角形表示B. subtilis。C 使用不同运动能力的B. subtilis菌株进行的搭便车实验。我们还使用失去了群集能力的B. subtilis实验室菌株（DK605；CI）以及运动受限的突变体（包括缺乏鞭毛的菌株Δhag；CII）、鞭毛旋转缺陷的菌株（ΔmotAB；CIII）和表面活性物质缺乏的菌株（ΔespH srfAA::mls；CIV）进行了搭便车实验。这些实验显示了不依赖于鞭毛的搭便车行为，而仅依靠游泳能力的菌株没有观察到扩散。

为了理解搭便车行为的本质，我们测试了C. pinensis在B. subtilis突变体存在下的搭便车能力，这些突变体在表面活性物质产生（ΔespH srfAA::mls）被抑制、鞭毛运动被抑制（ΔmotAB）或缺乏鞭毛（Δhag）的情况下仍能进行搭便车。此外，本研究还包括了一个失去了群集能力的B. subtilis实验室菌株（DK605；Muok et al. 2021）。测试表明，C. pinensis的搭便车行为与鞭毛运动和鞭毛的存在无关。虽然C. pinensis细胞可以通过B. subtilis的群集和滑动运动进行扩散，但它们不能被限制在游泳运动且无法产生表面活性物质的B. subtilis突变体（ΔespH srfAA::mls）所扩散。表面活性物质欺骗实验表明，C. pinensis的球形细胞会跟随培养基表面的表面活性物质扩散（图3B(I)）。

接下来，我们测试了在B. subtilis细胞存在的情况下，C. pinensis的球形细胞是否跟随表面活性物质的扩散，假设B. subtilis细胞产生的表面活性物质在其运动过程中分布在整个平板上。尽管整个平板上都有表面活性物质，C. pinensis细胞仍仅沿着B. subtilis的运动方向扩散（图3B(II)）。当球形细胞被放置在两个B. subtilis接种点之间时，C. pinensis的菌落保持在两者之间。尽管C. pinensis的球形细胞可以利用B. subtilis的表面活性物质进行扩散，但它们不能朝向与B. subtilis运动相反的方向扩散（图3B(II)）。

讨论

C. pinensis在文献中被描述为一种长丝状细菌，能够产生小球形体，这些小球形体常被称为粘液孢子、微囊或孢子，被认为是休眠阶段（Sangkhobol和Skerman 1981；Reichenbach 1992；Glavina Del Rio等人2010）。尽管这些术语经常被使用，但它们之间没有明确的定义或区分（Sly等人1999）。休眠被定义为一种适应状态，表现为代谢活动减少和生长停止，以增强在不利条件下的生存能力（McDonald等人2024）。它通常与结构和生理适应有关，如增厚的细胞壁、浓缩的DNA和对环境压力的增强抵抗力（McDonald等人2024）。然而，抗压测试和结构分析表明，C. pinensis的形态变化并不遵循经典的休眠相关分化特征。我们的转录组分析表明，球形细胞的基因表达模式发生了变化，暗示代谢减慢，尽管细胞继续增殖并保持独特的转录活性。此外，在测试条件下，20小时和40小时收获的细胞在生长行为上没有显著差异（在线资源3）。

应当注意的是，OD600测量可能受到细胞形态差异的影响。因此，基于OD的生长曲线仅在相对意义上进行解释，并且总是在相同的测量条件下进行。跨重复实验观察到的生长趋势在两个采样点是一致的。虽然不能仅从OD600值推断绝对生长率，但20小时和40小时培养得到的相对生长参数在同一重复实验中是可比的，表明在这些实验的约束范围内，估计的生长率是可靠的。

这些结果表明，C. pinensis实际上并没有真正进入休眠阶段，而是在分子水平上调整其转录谱，作为对营养可用性和环境条件变化的适应性响应。

形态可塑性是细菌中一种公认的生存策略，使它们能够动态响应环境变化。一些细菌在不利条件下会进行孢子形成，而另一些则会改变其形态特征以优化资源获取、躲避捕食或适应营养物质的波动。例如，大肠杆菌在受到压力时可以形成丝状体以避免被捕食，或缩小体积以降低代谢需求（Justice等，2006；Campey等，2024）。在这种情况下，C. pinensis能够在不同形态之间转换可能提供了类似的生态优势，有助于其在多样化的环境中持续生存。除了个体生存外，形态转换还可能在微生物群落动态和与宿主生物的相互作用中发挥作用。先前的研究表明，微生物的形态可以影响生物膜的形成、资源竞争以及在复杂微生物组中的种间相互作用（Justice等，2008；Rizzo等，2020；Karasz等，2022）。然而，正如Shah（2019）所指出的（Shah等，2019），细菌形态分化的生态后果仍然未得到充分研究。对于C. pinensis而言，其形态状态对其在植物微生物组中的功能作用的影响仍不清楚。

形态和转录可塑性对宿主-微生物群相互作用的相关性
以往关于形态可塑性的研究主要集中在应激反应上，往往会忽略同时发生的代谢变化（Ultee等，2019；Shah等，2019；Karasz等，2022）。因此，超出应激适应范围的形态与转录变化之间的联系仍未得到充分探索。C. pinensis所观察到的形态和转录可塑性挑战了传统假设，因为丝状体的形成通常与静止期适应相关，在这一阶段，次级代谢产物的产生优先于细胞生长，并作为应激反应发生（Xavier，2011）。通过这种方式，细菌确保次级代谢产物以低成本和高效益产生（Santamaria等，2022）。然而，在C. pinensis中，早期生长阶段的丝状化伴随着与次级代谢相关的基因转录增加，此时营养物质丰富且细胞密度较低。丝状化在能量上代价高昂，可能会降低适应性和承载能力（Karasz等，2022；Santamaria等，2022），这表明它必须为C. pinensis提供某种补偿性优势。丝状化与多种生态优势相关，包括改善表面相互作用、生物膜形成、在异质环境中的资源获取以及可能的细胞内扩散机制（Wucher等，2019；Nunan等，2020；Tran等，2022）。C. pinensis中形态和转录可塑性的相互作用反映了整个共生体内的复杂调控网络，可能有助于微生物的稳定性和适应性。然而，需要进一步的研究来确定这些形态转换在竞争性环境中是否提供生态优势，以及它们如何影响植物-微生物相互作用（Xavier，2011；Lyons和Kolter，2018）。

反复形态变化的隐藏触发因素
为了识别超出应激因素的形态变化触发因素，测试了三个常见的因素——营养物质的可用性、培养基中的成分以及细胞密度（Weart等，2007；Rizzo等，2020）。由于这些因素同时存在，因此无法单独进行测试。相反，它们被改变浓度，并分析了形态变化的速度。尽管付出了努力，但没有明确找到触发因素，这表明生长条件和调控机制之间存在复杂的相互作用。先前的研究表明，触发因素仅在特定条件下有效。如果这些条件不满足，细胞的调控机制会介入并阻止反应（Karasz等，2022）。这可以解释为什么在SMT中丝状细胞的体积在六小时后增加了，而在SM中则继续减小（在线资源6）。这两种培养基都来源于球形细胞，但在营养成分上有所不同。此外，在初始细胞密度较高的情况下，这种效应不存在，这进一步表明调控机制之间存在复杂的相互作用。触发因素也可能被次要效应所掩盖。有研究表明高磷酸盐浓度可能触发Paraburkholderia elongata的丝状化（Karasz等，2022）。然而，进一步分析显示，实际触发因素是镁缺乏，这是由于细胞内多磷酸盐的螯合。同样，我们的发现表明C. pinensis的形态变化与细胞密度有关。这一观点得到了观察结果的支持，即丝状细胞在细胞长度动态上表现出依赖于密度的差异，而球形细胞在所有测试条件下体积都增加了（在线资源6）。这可能是由于稀释效应，因为球形细胞是从高密度培养中收获的，可能触发了形态转换。生长速率，而不仅仅是细胞密度本身，也可能在形态变化中起关键作用（Weart等，2007；Xavier，2011；Tran等，2022）。代谢传感器UDP-葡萄糖已被证明可以通过控制FtsZ环的组装来将碳的可用性与生长速率联系起来，FtsZ环是细菌细胞分裂的关键调节因子（Weart等，2007；Xavier，2011；Tran等，2022）。然而，C. pinensis在基因上难以操作，尽管我们做了大量尝试，但仍无法表达FtsZ-GFP。

球形细胞可以“搭便车”并可能利用其他细菌的趋化性
尽管已知其他C. pinensis菌株可以通过IX型分泌系统（T9SS）进行运动（McBride和Zhu，2013），但在我们的实验中无法诱导这种运动。这一限制促使我们探索形态可塑性是否提供了超出代谢效率的其他优势。鉴于C. pinensis球形细胞的大小较小（600–700纳米），它们可能通过植物组织中的血管压力进行运输。然而，它们在土壤中的运动情况尚不清楚。由于缺乏趋化基因，它们可能依赖于其他运动细菌进行传播。先前的研究表明，一些非运动细菌会利用其他细菌的运动能力进行扩散。例如，链霉菌的孢子可以附着在运动细菌的鞭毛上（Muok等，2021），而葡萄球菌的球形细胞可以直接附着在游泳细菌的细胞体上并被被动运输（Samad等，2017）。在我们的实验中，C. pinensis的球形细胞表现出“搭便车”行为，但与链霉菌孢子不同，这种相互作用与载体细菌的运动能力和鞭毛的存在无关。值得注意的是，这种行为在菌落形成平板上观察到，而在游泳平板上未观察到（图3C）（Li等，2021；Engelhardt等，2022）。此外，滑动、蔓延和菌落形成被认为是群体运动，而游泳是单独的行为（Kearns等，2010；Mattingly等，2018）。群体运动是一种节省能量、具有保护性且高效的运输机制，可以在营养异质环境中优化资源搜索（Ariel等，2015；Nunan等，2020；Engelhardt等，2022）。C. pinensis中的形态和转录可塑性相互作用反映了整个共生体中的复杂调控网络，有助于微生物的稳定性和适应性。然而，需要进一步的研究来确定这些形态转换在竞争性环境中是否提供生态优势，以及它们如何影响植物-微生物相互作用（Xavier，2011；Lyons和Kolter，2018）。

隐藏的形态变化触发因素
为了识别超出应激因素的形态变化触发因素，测试了三个常见的因素——营养物质的可用性、培养基中的成分和细胞密度（Weart等，2007；Rizzo等，2020）。由于这些因素同时存在，因此无法单独测试。相反，改变了它们的浓度，并分析了形态变化的速度。尽管如此，仍未确定明确的触发因素，这表明生长条件和调控机制之间存在复杂的相互作用。先前的研究表明，触发因素仅在特定条件下有效。如果这些条件不满足，细胞的调控机制会介入并阻止反应（Karasz等，2022）。这可以解释为什么在SMT中的丝状细胞在六小时后体积增加，而在SM中则继续减小（在线资源6）。这两种培养基都来源于球形细胞，但在营养成分上有所不同。此外，在初始细胞密度较高的情况下，这种效应不存在，这进一步表明调控机制之间存在复杂的相互作用。触发因素也可能被次要效应所掩盖。有研究表明高磷酸盐浓度可能触发Paraburkholderia elongata的丝状化（Karasz等，2022）。然而，进一步分析显示，实际触发因素是镁缺乏，这是由于细胞内多磷酸盐的螯合。同样，我们的发现表明C. pinensis的形态变化与细胞密度有关。这一点从观察结果中也得到支持，即丝状细胞在细胞长度动态上表现出依赖于密度的差异，而球形细胞在所有测试条件下体积都增加了（在线资源6）。这可能是由于稀释效应，因为球形细胞是从高密度培养中收获的，可能引发了形态转换。生长速率，而不仅仅是细胞密度本身，也可能在形态变化中起关键作用（Weart等，2007；Xavier，2011；Tran等，2022）。代谢传感器UDP-葡萄糖已被证明可以通过控制FtsZ环的组装来将碳的可用性与生长速率联系起来，FtsZ环是细菌细胞分裂的关键调节因子（Weart等，2007；Xavier，2011；Tran等，2022）。然而，C. pinensis在基因上不易操作，尽管我们做了大量尝试，但仍无法表达FtsZ-GFP。

球形细胞可以“搭便车”并可能利用其他细菌的趋化性
尽管已知某些C. pinensis菌株可以通过IX型分泌系统（T9SS）进行运动（McBride和Zhu，2013），但在我们的实验中无法诱导这种运动。这一限制促使我们探索形态可塑性是否提供了超出代谢效率的其他优势。鉴于它们的小尺寸（600–700纳米），C. pinensis的球形细胞可能通过植物组织中的血管压力进行运输。然而，它们在土壤中的运动情况仍不清楚。如果没有趋化基因，它们可能依赖于其他运动细菌进行传播。先前的研究表明，一些非运动细菌会利用其他细菌的运动能力进行扩散。例如，链霉菌的孢子可以附着在运动细菌的鞭毛上（Muok等，2021），而葡萄球菌的球形细胞可以直接附着在游泳细菌的细胞体上并被被动运输（Samad等，2017）。在我们的实验中，C. pinensis的球形细胞表现出“搭便车”行为，但与链霉菌孢子不同，这种相互作用与载体细菌的运动能力和鞭毛的存在无关。值得注意的是，这种行为在菌落形成平板上观察到，而在游泳平板上未观察到（图3C）（Li等，2021；Engelhardt等，2022）。此外，滑动、蔓延和菌落形成被归类为群体运动，而游泳是单独的行为（Kearns，2010；Mattingly等，2018）。群体运动是一种节能、保护和高效的运输机制，可以在营养异质环境中（如土壤）优化资源搜索（Ariel等，2015；Nunan等，2020；Engelhardt等，2022）。显微镜成像进一步支持C. pinensis的“搭便车”行为是短暂的，而不是稳定的附着，这与链霉菌孢子不同。如图3B(III)所示，C. pinensis细胞与B. subtilis的小细胞松散地结合，可能是通过疏水相互作用。值得注意的是，图3B(III)显示了一个小的、杆状的C. pinensis细胞与B. subtilis结合。由于使用的是球形细胞作为接种物，不能排除一些细胞在“搭便车”实验条件下发生了伸长。然而，这种变化在多大程度上促进了C. pinensis的“搭便车”行为仍不清楚。

在密集的细菌群落中，种群经常以类似液体-晶体的排列方式排列，从而促进集体运动（Meacock等，2021）。与此一致，C. pinensis的球形细胞与B. subtilis一起移动，而不是独立分散，尽管它们能够利用表面活性剂进行“作弊”。在合作群落中，对公共资源（如表面活性剂）的“作弊”是一种常见的策略（Xavier等，2011；Lyons和Kolter，2018）。然而，B. subtilis采用调控机制来减轻作弊者的影响（Lyons和Kolter，2018）。因此，虽然观察到了“搭便车”行为，但尚不清楚C. pinensis是主动参与这一过程，还是被动地由B. subtilis的群体运动驱动。澄清这一区别对于理解细菌的扩散机制和植物根系的定植至关重要。

无论C. pinensis“搭便车”的确切机制是什么，这种行为可能代表了一种新的细菌扩散方式，使非运动细菌能够在结构化环境中实现空间重新定位。每一项知识都有助于揭示和理解宿主-微生物群之间的动态相互作用。此外，还需要回答关于移动和不动细菌之间的关键比例如何仍保持群落运动性的问题。考虑到有些细菌在低细胞密度时具有运动能力，而在高细胞密度时则没有，这就引发了这样的问题：这种比例是否有助于群落在不同条件下保持运动性。研究“搭便车”行为在植物根系存在的情况下对这种运动的影响也很有趣。一些问题可以在未来使用透明土壤和光片荧光显微镜的研究中探索。

结论
气候变化和传统农业造成的污染降低了资源质量，给植物带来了额外的压力，削弱了它们的抵抗力。保护植物微生物群中天然存在的保护性微生物可以提高植物的抵抗力和免疫力。为了理解植物与其微生物群之间的复杂相互作用以及微生物群内部的作用机制，首先必须识别关键成员，然后揭示它们的相互作用机制。其中一个关键成员是C. pinensis，它以其促进植物健康的特性而闻名，表现出从长丝状体到小球形细胞的显著形态可塑性转变，伴随着明显的转录变化。尽管发生了这种转变，球形细胞仍不表现出休眠状的特征，如结构分化、抵抗力增强或生长停止，但仍然具有繁殖能力。此外，转变为小球形细胞可能促进了通过运动细菌介导的无需鞭毛的运输。需要进一步的研究来揭示形态和代谢可塑性的触发和调控机制，以及它们在动态和复杂相互作用中的作用。此外，还必须研究通过“搭便车”或群体运动进行的运输在植物组织中的定植和分布程度。解开这些机制有助于利用微生物群的力量来促进植物健康，并在日益挑战的环境中培养具有抵抗力的农业。

材料与方法
菌株和培养条件
Chitinophaga pinensis 94是从Carrion实验室的培养物收集中获得的（Carrión等，2019），并在0.1×TSB培养基中加入40%的甘油，在25°C下振荡（250rpm）培养过夜。培养16小时后，将100 μl的过夜培养物稀释到50 ml 0.1×TSB培养基中，在相同条件下继续培养20小时以获得长丝状细胞，再培养40小时以获得小球形细胞（<1 μm）。通过离心（30分钟；8000 g；4°C）收获细胞。之后，使用光显微镜（Axion Imager M2；Zeiss）检查细胞形态，然后再进行任何实验。本研究中使用的所有Bacillus subtilis菌株（未驯化的Bacillus subtilis (NCIB3610)；B. subtilis DK605 (Δmind::TnYLB)；DS1677 (Δhag)；DS222 (ΔmotAB)；DK1484 (ΔespH srfAA::mls) 的培养方法如前所述（Muok等，2021）。B. subtilis小细胞菌株 (DK605; Δmind::TnYLB) 的培养和收获方法也如前所述（Muok等，2021）。在实验之前，通过显微镜评估了培养物的细胞形态；在下文中，20小时和40小时的培养物分别被称为丝状细胞和球形细胞，除非另有说明。除非另有说明，否则下面描述的实验均重复三次（N=3）。

触发因素检测
在0.1×TSB培养基（25°C；250 rpm）中培养20小时（OD600=0.2）和40小时（OD600=0.5）后的C. pinensis细胞通过离心（8000×g；30分钟；4°C）收获。每个样本用新鲜培养基（0.1×TSB）调整至OD600为0.2和0.5，并分装1 ml。然后所有样本再次离心（8000×g；30分钟；4°C），弃去上清液，使用沉淀物进行下一步实验。

培养基和培养上清液的准备
为了测试培养物衍生物成分是否影响细胞长度动态，通过离心（8000×g；30分钟；4°C）和过滤（0.2 μm）提取20小时和40小时C. pinensis培养的上清液。这些培养基分别称为“长丝状细胞培养基”（LM）和“小球形细胞培养基”（SM）。新鲜的TSB与SM按1:10稀释，下文称为“SMT”。此外，还使用磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7）和新鲜的0.1×TSB培养基（FM）作为参考培养基。实验设置见在线资源8。每个样本的等份液重新悬浮在相应准备的培养基中1 ml中，然后转移到96孔板（MegaBlock?；2.2 ml；Sarstedt）中，然后在25°C和250 rpm下孵育。3小时和6小时后，从所有孔中取样，用Syto9（1 μM）处理，并用4%甲醛固定。所有样本用倒置荧光显微镜（Zeiss Axio Imager M2配AxioCam MRc 5）成像，并使用ImageJ（Schneider等，2012）的AutoTreshold功能确定细胞长度数据。所得数据通过图形方式进行了可视化处理，p值是通过混合效应回归模型获得的，该模型使用了细胞长度的对数来近似模拟正态分布，并通过加入“重复”这一随机效应来考虑数据间的依赖性。混合模型的构建使用了lme4软件包，p值的计算则分别通过lmerTest和emmeans软件包完成（Bates等人，2015年；Kuznetsova等人，2017年；Lenth等人，2024年）。

**运动能力测定**
运动能力测试是在0.1×TSB琼脂平板（直径9厘米）上进行的，其中用于群体形成的平板含有0.5%的琼脂，而用于游泳行为的平板含有0.27–0.3%的琼脂。首先，从过夜培养的LB培养基中制备新的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）及其突变体菌株，并在LB培养基中（37°C；200 rpm）孵育，直到OD600值达到0.5。随后，使用无菌环从C. pinensis平板（0.1×TSA；25°C；培养时间超过1周）中收集细胞，并将其重悬在200 μl的0.1×TSB培养基中。在测试前通过光学显微镜验证了接种物的细胞形态，确认其主要由球形细胞组成。为了测定“搭便车”行为，将3 μl的枯草芽孢杆菌细胞转移到平板上，再将3 μl的C. pinensis细胞悬浮液直接滴加到所需接种位置（可以直接滴在枯草芽孢杆菌的接种点上，也可以滴在平板的其他位置）。对于在游泳平板（0.27–0.3%琼脂；LP0011；Oxoid）上的“搭便车”实验，接种后用无菌环在每个接种点上制造一个小孔以促进细胞在琼脂中的游动。平板在25°C下孵育最多5天，并在透光箱中拍摄图像。实验重复三次，使用的培养基为Bacto? Agar（BD）和Agar No. 1（LP0011；Oxoid）。为了对比和控制实验结果，每种条件也针对每个菌株单独进行了测试。

**表面活性剂欺骗测定**
表面活性剂欺骗实验是在含有0.1×TSA（0.5%琼脂）的培养基中进行的，实验中使用了来自枯草芽孢杆菌的表面活性剂（Sigma-Aldrich；St. Luis；密苏里州；美国）。为了将表面活性剂加入培养基中，先将10 ml培养基在微波炉中加热至液化，冷却至室温后加入10 μl的表面活性剂（浓度为10 g/L）。对于同时添加钾离子的欺骗实验，在液态培养基中加入了70 μl的K2HPO4（1 M）。随后将培养基倒入直径9厘米的培养皿中并使其固化。通过对培养基平板进行表面处理，将10 μl的表面活性剂（10 g/L）滴加到平板中心，并置于通风橱中直至表面活性剂完全扩散到琼脂中。该过程使用1 g/L的表面活性剂溶液重复进行。所有平板均接种了一个来自起始平板（0.1×TSA；1.5%琼脂）的C. pinensis单菌落。平板在25°C下孵育3天后在透光箱中拍摄图像。实验重复三次。作为对照，也分别对不含表面活性剂和不含钾离子的培养基进行了相同处理。

**荧光显微镜观察**
荧光显微镜观察用于评估和确认GFP是否成功整合到C. pinensis的基因组中。为此，从平板上选取一个菌落，将其悬浮在3–5 μl的PBS缓冲液中并覆盖上盖玻片。显微镜观察和成像使用的是配备AxioCam MRc 5相机的Zeiss Axio Imager M2设备。GFP的荧光信号在Ex 488 nm和Em 510 nm波长下被检测并使用Zeiss Zen软件进行分析。

**冷冻电子显微镜观察**
如上所述，从枯草芽孢杆菌DK605（Δmind::TnYLB）菌株中获得的细胞沉淀被重新悬浮在12 μl的LB培养基中。使用无菌环从培养2周的0.1×TSB平板（1.5%琼脂）中收集C. pinensis球形细胞，并将其转移到200 μl的0.1×TSB培养基中。从C. pinensis细胞悬浮液中取出2 μl加入到12 μl的枯草芽孢杆菌细胞混合液中，并加入10 nm的金胶体溶液（来自荷兰乌得勒支大学的Cell Microscopy Core实验室），稀释比为1/10。轻轻混合后，在室温下孵育30分钟。随后，将3 μl的混合液滴加到经过预处理过的200目R2/2铜网格（Quantifoil Micro tools）上，先在90%相对湿度的环境中曝光30秒，然后再曝光1秒。网格使用自动Leica EM GP系统（Leica Microsystems）在液态乙烷中快速冷冻，然后储存在液氮中。网格的成像是在荷兰电子纳米显微镜中心（NECEN）使用120 kV的Talos L120C冷冻电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）完成的。

**冷冻电子断层扫描**
C. pinensis细胞的制备方法如上所述，样品在孵育20小时和40小时后采集。样品随后在3000×g的离心力下离心5分钟，细胞沉淀被重新悬浮在20 μl的培养基中。在此基础上，加入10 nm的金胶体溶液（来自荷兰乌得勒支大学的Cell Microscopy Core实验室），稀释比为1/10，并通过移液器小心混合。为了进行玻璃化处理，将3 μl的样品滴加到预处理过的网格上并快速冷冻。图像数据使用TITAN Krios显微镜（TFS）采集，该显微镜配备了Gatan K3 Summit直接电子探测器和你GATN GIF量子能量过滤器（狭缝宽度为20 eV）。图像的名义放大倍数为26,000倍，对应的像素大小为3.28 ?。倾斜序列的采集采用SerialEM软件和双向剂量对称倾斜方案（?60°–60°；从0°开始，步长为2°）进行。偏置范围设定在?8至?10 μm之间，每个倾斜序列的累积曝光时间为100 e?/A2。倾斜序列的对齐基于珠子追踪和漂移校正方法完成（Xiong等人，2009年），并使用CTFplotter软件来确定和校正对比度传递函数（Pham和Parkinson，2011年）。