在番木瓜（Carica papaya L.）中，介导胚胎性愈伤组织诱导的蛋白质网络会对剂量依赖性的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid）处理产生反应

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Protein networks mediating embryogenic callus induction in Carica papaya L. respond to dose-dependent 2,4-dichlorophenoxyacetic acid treatment

　　**摘要**
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）被广泛用于诱导体细胞胚胎发生（SE），但调控这一过程的浓度依赖性分子机制仍不明确。本研究探讨了番木瓜（Carica papaya）合子胚胎在不同浓度（0-200 μM）的2,4-D处理下的形态反应和蛋白质组变化，以识别胚胎发生能力的调控途径。形态学分析显示，只有在20 μM的2,4-D浓度下，胚胎才能在第14天形成胚胎性愈伤组织；而超过最佳浓度的2,4-D则会延迟或阻碍SE过程。在诱导后第7天进行的无标记定量蛋白质组分析共鉴定出1168种蛋白质，其中726种在愈伤组织形成初期表现出差异性积累。聚类分析揭示了六种剂量依赖性的蛋白质积累模式：高浓度2,4-D主要抑制与生长素信号传导、蛋白酶体介导的蛋白质周转、甲基化相关代谢、质子转运和染色质重塑相关的蛋白质。相比之下，中等浓度的2,4-D保持了质子泵活性，维持了SCF-AUX/IAA信号通路，促进了GH3介导的生长素结合，并增强了SAM/SAHH依赖性的甲基化过程，从而创造了有利于细胞重编程的分子环境。在200 μM的2,4-D浓度下，蛋白质组谱显示合成代谢、氧化还原反应和发育相关通路受到协同抑制，这从代谢和能量相关GO术语的富集程度较低中可以得出。功能富集分析也表明，仅有少数与应激相关的类别被激活，其中缺氧是最显著的富集术语。综合GO分析和KEGG分析结果表明，过量的生长素会同时抑制核心代谢通路，并无法激活广泛的应激适应程序，从而破坏胚胎发生所需的相互作用功能模块。这些发现表明，番木瓜的SE过程受限于一个狭窄的生长素浓度窗口，在此窗口内生长素需要平衡激素信号传导、蛋白质稳态、代谢活性和染色质调控；而过量的生长素则会使蛋白质组向代谢抑制状态转变。本研究为优化番木瓜中的基于生长素的SE协议提供了机制框架。

**引言**
体细胞胚胎发生是一种类似于合子胚胎发生的形态发生过程，其中单个细胞或一小群体细胞作为胚胎的前体，能够萌发并再生出完整的植物（Loyola-Vargas和Ochoa-Alejo 2016）。体细胞胚胎可以直接从外植体产生（直接体细胞胚胎发生），也可以在形成愈伤组织后间接产生（间接体细胞胚胎发生）。在受控和无菌的体外条件下，体细胞胚胎发生具有广泛应用于多种植物的潜力（Fehér 2015；Gladfelter等人2021），尽管其背后的机制优化和深入理解仍有许多未知之处。间接体细胞胚胎发生由基因和蛋白质之间的复杂相互作用网络调控，使其成为高效微繁殖和生物技术应用（如基因工程和基因组编辑）的有希望的方法（Heringer等人2018；Salaün等人2021）。在用于诱导这一过程的化合物中，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一种常用的生长素类物质，可在植物组织培养中诱导愈伤组织形成（Raghavan 2004；Peterson等人2016）。2,4-D可以激活生长素信号通路，包括TIR1/AFB受体介导的通路，从而导致AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID（Aux/IAA）转录抑制因子的降解和生长素响应基因的激活（Song 2014；Leyser 2018）。除了在中等浓度下促进愈伤组织形成和胚胎发生能力外，高浓度的2,4-D还会导致遗传、表观遗传和生理紊乱，以及体细胞胚胎的形态异常（de Morais Oliveira等人2023）。即使在后期发育阶段，成熟过程中的残留2,4-D也会影响体细胞胚胎的分化，破坏内源性生长素的平衡和分布，延迟储存储备的积累，并改变参与应激反应、激素信号传导和储备代谢的关键蛋白质的丰度（Reis等人2021）。这些发现强调了优化2,4-D浓度的重要性，以在保持适当胚胎分化和发育的同时提高体细胞胚胎发生的效率。微繁殖协议，特别是涉及体细胞胚胎发生的协议，通常依赖2,4-D来建立胚胎性细胞系。本研究探讨了不同浓度的2,4-D如何在番木瓜早期体细胞胚胎发生过程中影响蛋白质组谱，以揭示其调控机制。我们的发现表明，不同浓度的2,4-D与与体细胞胚胎发生相关的蛋白质的差异性积累有关，特别是那些参与激素信号传导和表观遗传调控的蛋白质，这支持了它们在获取胚胎发生能力中的作用。这些见解为优化该物种的体外繁殖协议提供了宝贵信息。

**材料与方法**
**植物材料与愈伤组织诱导**
将‘Golden’品种的成熟番木瓜果实用流动水冲洗，并在无菌条件下用70%乙醇（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）浸泡1分钟进行表面消毒，然后用含有1.25%次氯酸钠的50%（v/v）商业漂白剂（Qboa?，巴西奥斯阿斯科）浸泡30分钟。再次用去离子水和高压蒸汽灭菌水冲洗三次后，将果实对半切开，取出成熟的合子胚胎作为外植体。在含有20 mL Murashige和Skoog培养基（Phytotechnology Lab，美国奥弗兰帕克）的培养皿中培养胚胎，培养基中添加了30 g L?1蔗糖（Labsynth，巴西迪阿德玛）和2,4-D（0, 0.2, 2, 20, 或200 μM），并用2 g L?1 Phytagel?（Sigma-Aldrich）固化。调整培养基的pH至5.8±0.1，然后在121°C下高压蒸汽灭菌15分钟。合子胚胎在添加了不同2,4-D处理的培养基中培养，并在25±1°C的黑暗环境中孵育。在培养开始后第7天收集部分外植体进行蛋白质组分析，以捕捉与胚胎发生重编程相关的早期分子事件。每种处理准备三个生物学重复实验，每个重复实验包含来自十五个独立外植体的混合材料。其余的外植体在42天内每七天进行一次形态监测。

**蛋白质提取与消化**
对于蛋白质组分析，采集在不同2,4-D处理下培养的合子胚胎在诱导后第7天的外植体。每个处理准备三个生物学重复实验，每个重复实验包含来自十五个独立外植体的混合样本。将外植体在1.5 mL微管中捣碎至完全均质。随后加入300 μL提取缓冲液，其中包括7 M尿素（Cytiva，PlusOne?，瑞典）、2 M硫脲（Cytiva）、2% Triton X-100（Sigma-Aldrich）和1% dithiothreitol（Bio-Rad，美国赫拉克勒斯）。使用Bradford测定法（Bio-Rad，美国赫拉克勒斯）（Bradford 1976）测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，并根据植物组织的程序进行调整。同时加入仅含提取缓冲液的空白对照以排除干扰。使用微孔板分光光度计在595 nm处测量吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度。每份样本使用100 μg蛋白质进行消化。根据Nanjo等人（2012）的方法，使用甲醇/氯仿方法去除干扰化合物和洗涤剂污染物。将所得蛋白质沉淀物重新悬浮在含有7 M尿素和2 M硫脲的变性缓冲液中。按照Wi?niewski等人（2009）描述的FASP协议进行胰蛋白酶消化，并根据Xavier等人（2025）的修改进行了调整。简单来说，蛋白质样本首先在Microcon-30 kDa离心过滤器（Merck Millipore，德国达姆施塔特）上用50 mM碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，pH 8.5）进行双脱盐。然后，在60°C下用100 μL含有8 M尿素和50 mM碳酸氢铵的溶液中的50 mM dithiothreitol孵育20分钟进行还原。还原完成后冷却，加入200 μL含有8 M尿素和50 mM碳酸氢铵的溶液，然后在25°C下用100 μL含有50 mM iodoacetamide的溶液在黑暗中烷基化20分钟。接着用8 M尿素和50 mM碳酸氢铵的溶液冲洗过滤器两次，再用50 mM碳酸氢铵冲洗三次以去除残留试剂。蛋白质在37°C下用序列级胰蛋白酶（V5111，Promega，美国麦迪逊）以1:100的酶与蛋白质比例消化18小时。为了失活胰蛋白酶并沉淀RapiGest，加入5 μL 15%三氟乙酸（Sigma-Aldrich）至最终浓度为0.5%，然后在37°C下孵育30分钟。将所得肽类真空干燥，并在含有5%（v/v）LC-MS级乙腈（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）和0.1%（v/v）甲酸（Sigma-Aldrich）的溶液中重新悬浮至最终浓度为0.7–1 μg μL?1。使用NanoDrop Onec分光光度计（Thermo Fisher Scientific，英国曼彻斯特）在A205 nm处测量吸光度，并直接将样品注入质谱仪进行LC-MS/MS分析。

**质谱分析**
质谱分析基于Passamani等人（2018）描述的参数进行。使用nanoAcquity UPLC M-class（Waters，英国曼彻斯特）与Synapt G2-Si质谱仪（Waters，英国曼彻斯特）结合，该质谱仪配备了电喷雾离子化（ESI）-MS/MS源。将2 μg肽加载到ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap柱（100 ?，5 μm，180 μm × 20 mm，Waters）上，流速为5 μL min?1，持续3分钟，然后加载到ACQUITY UPLC M-Class HSS T3分析反相柱（100 ?，1.8 μm，75 μm × 150 mm；Waters）上，流速为400 nL min?1，加热至45°C。肽的分离采用二元梯度洗脱系统。流动相A为含0.1%甲酸的MS级水，流动相B为含0.1%甲酸的MS级乙腈。梯度从5% B开始，在92分钟内线性增加到40% B；从92分钟到96分钟，流动相B的浓度增加到99%并保持恒定；然后在102分钟内降至5%并维持到实验结束（118分钟）。质谱仪以正离子模式运行，分辨率设为35,000 FWHM（V模式），数据独立采集（DIA）通过离子迁移率分离（HDMSE）实现。离子迁移率从800升至500 m s?1。高能量模式下的碰撞能量从25升至55 V。锥形电压设为40 V，毛细管电压设为2.8 kV。其他源参数包括纳米流气体压力为0.5 bar，净化气体流量为150 L h?1，源温度为80°C。在飞行时间（TOF）采集过程中，连续模式下扫描时间设置为0.6秒，覆盖的m/z范围是从50到2000 Da。外部校准使用的是浓度为100 fmol μL?1的人类[Glu1]-纤维肽B，并且每30秒进行一次锁质量校正。数据采集使用了MassLynx版本4.1（Waters）。

蛋白质组学数据分析
MS/MS光谱处理和数据库搜索使用了ProteinLynx Global SERVER（PLGS）软件v.3.02（Waters），并针对Phytozome的C. papaya ASGPBv0.4蛋白质库进行（访问日期为2024年8月30日）。原始数据处理的设置包括低能量阈值为150计数、高能量阈值为50计数以及强度阈值为750计数。此外，分析还采用了以下参数：允许两次切割失败，每个肽至少有三个片段离子，每种蛋白质至少有七个片段离子，每个蛋白质至少有两个肽，固定氨基甲酰甲基（C）修饰，以及可变的甲硫氨酸氧化和磷酸化（STY）修饰。肽和蛋白质鉴定的假发现率（FDR）被设定为最大1%，最小肽长度为六个氨基酸，并且自动设置了肽和片段的质量容忍度。无标记定量分析采用了TOP3定量方法，然后使用ISOQuant软件v.1.7（Distler等人，2014年）进行了多维归一化处理。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴仓库存入ProteomeXchange联盟（Perez-Riverol等人，2025年），数据集标识符为PXD072983。为了确保数据的可靠性，只有那些在所有三个生物学重复实验中都一致的蛋白质被纳入差异积累分析。如果基于Student’s t检验（双尾，p<0.05）显示出统计上的显著差异，并且log?倍变化（FC）大于0.58（上调）或小于-0.58（下调），则将这些蛋白质分类为差异积累蛋白质（DAPs）。此外，那些仅在一个处理条件下被检测到的蛋白质（即在一种处理的所有重复实验中都存在而在另一种处理中完全没有出现的蛋白质）也被视为差异积累的蛋白质，因为它们反映了特定条件下的表达。在五种2,4-D浓度（0、0.2、2、20和200 μM）之间进行了所有成对比较，共进行了十次差异分析。

在蛋白质鉴定之后，使用UniProt和TAIR（最后访问日期为2024年9月10日）验证了它们的本体和生物学功能。使用g: Profiler工具（Kolberg等人，2023年），通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）的同源物对DAPs进行了生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）和KEGG（京都基因和基因组百科全书）通路的富集分析（p值<0.05）。这些同源物还被用来使用STRING v12数据库（Szklarczyk等人，2023年）预测蛋白质-蛋白质相互作用网络，并使用iTAK（Zheng等人，2016年）鉴定激酶、转录因子和转录调节因子。Mfuzz包（Kumar和Futschik，2007年）被用来对在至少一次诱导处理中检测到的DAPs进行聚类分析。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析按照Pacheco等人（2023年）的方法进行。简而言之，使用Cytoscape 3.10.4（Shannon等人，2003年）的StringApp插件来识别差异表达蛋白质之间的关联，并设置了0.700的置信度阈值来可视化PPI网络。MCODE（分子复合体检测）应用程序被用来从网络中提取高度连接的蛋白质簇（模块），同时将度阈值设置为≥3，其他参数保持默认设置（节点得分阈值≥2，K-Core≥2，最大深度=100）。最后，使用CytoHubba插件通过最大团中心性（MCC）排名方法从PPI网络中提取前10个枢纽蛋白质，该方法计算每个蛋白质节点的度（Bader和Hogue，2003年）。

2,4-D诱导的C. papaya外植体的形态反应
生长素类除草剂2,4-D广泛用于诱导植物的体细胞胚胎发生，其效应具有明确的剂量依赖性。为了加深这一理解，我们评估了不同浓度的2,4-D对合子胚外植体早期形态反应的影响。在体外培养的初始阶段，即在可见愈伤组织形成之前，其形态特征如图1所示。在时间零点，外植体表现出完整的子叶和形态良好的胚胎轴（图1a）。七天后，未处理2,4-D的外植体正常发芽并长出根毛（图1b），而用0.2和2 μM 2,4-D处理的外植体则表现出发芽部分受抑制（图1c-d）。暴露于20 μM 2,4-D的外植体开始显示出发育方向的改变，表现为子叶打开和根尖伸出受到抑制，这表明其生长模式发生了偏离（图1e）。尽管在这个阶段还没有形成宏观可见的愈伤组织，但用20和200 μM 2,4-D处理的外植体表现出明显的形态特征，表明细胞正在重新编程（图1e-f）。在第七天，无论是20 μM还是200 μM 2,4-D处理的外植体都观察到了子叶打开和根系发育缺失（图1e-f）。只有在20 μM 2,4-D处理的外植体中，在第14天时确认形成了可见的愈伤组织（补充图S1），而在同一时间点，200 μM 2,4-D处理的外植体中没有观察到这种形成。在第14天，只有用20 μM 2,4-D处理的外植体形成了可见的愈伤组织，而在200 μM 2,4-D处理的外植体中则没有（补充图S1）。到第14天，只有用20 μM 2,4-D处理的外植体形成了愈伤组织，而200 μM 2,4-D处理的外植体尽管早期形态相似，但并未显示出愈伤组织的形成。这种差异表明在诱导期间生长素的浓度引起了不同的反应。

图1
不同2,4-D浓度下C. papaya外植体在体细胞胚胎发生诱导过程中的形态变化。(a) 从种子中分离出的合子胚胎（初始状态，时间0）；(b) 七天无2,4-D诱导（对照）；(c) 七天0.2 μM 2,4-D诱导；(d) 七天2 μM 2,4-D诱导；(e) 七天20 μM 2,4-D诱导；(f) 七天200 μM 2,4-D诱导。比例尺：4毫米
在没有2,4-D的情况下，胚胎正常发芽并生长，整个期间生长一致。在低浓度2,4-D（0.2和2 μM）下，虽然发生了发芽，但随着时间的推移逐渐受到抑制，导致幼苗发育受阻，且没有明显的愈伤组织形成（补充图S1）。在20 μM 2,4-D处理中，大约在第14天开始观察到愈伤组织的形成迹象，此时外植体逐渐发展出典型的胚胎发生愈伤组织的紧凑、褐色结构。到了第21天，外植体完全转变为愈伤组织，不再保留任何合子胚胎的形态特征。这些组织一直生长并成熟到第42天，保持了典型的胚胎发生愈伤组织的致密和有序外观。
在最高的2,4-D浓度（200 μM）下，外植体直到第21天才开始形成类似愈伤组织的结构。这些结构是半透明的和白色的，与20 μM 2,4-D处理下形成的紧凑的褐色愈伤组织形成对比。此外，原始合子胚胎的残留物，如持续的子叶仍然清晰可见，表明细胞重编程不完全。到第42天，用200 μM 2,4-D处理的外植体完全转化为愈伤组织，但这些组织仍然缺乏20 μM 2,4-D处理在同一时间点所观察到的结构完整性和形态特征。总的来说，图1和补充图S1中的形态分析表明，用20 μM 2,4-D处理的外植体在大约第14天开始形成可见的胚胎发生愈伤组织。因此，为了研究在可见愈伤组织形成之前发生的分子变化，这些变化可能与获得胚胎发生能力有关，选择在诱导后第七天进行蛋白质组学分析，这代表了在可检测到的形态分化之前的早期细胞重编程阶段。

外植体蛋白组受2,4-D以剂量依赖的方式调节
在诱导后第七天，使用来自所有测试的2,4-D浓度（0、0.2、2、20和200 μM）的外植体进行了自下而上的蛋白质组学分析，以检查与生长素剂量变化相关的蛋白组响应。这种方法揭示了蛋白组中的剂量依赖性改变，导致识别并量化了1168个C. papaya蛋白质（补充图S2a；补充表S1）。经过统计和倍数变化分析后，有726个蛋白质在2,4-D处理的十个可能的成对比较中至少有一个中被分类为DAPs，反映了在不同生长素条件下外植体水平的广泛蛋白质组重编程。主成分分析（PCA）显示样本根据2,4-D浓度有明显的分离，表明每种处理在外植体中引起了不同的蛋白组谱型（补充图S2b）。所有DAPs进一步通过BLASTp与TAIR中的拟南芥（A. thaliana）蛋白质进行注释，并根据它们的Mfuzz表达簇进行分组（补充表S2）。
在DAPs中，受2,4-D调控的主要生物过程（BP）包括蛋白质折叠、酰胺生物合成过程、翻译、酰胺和肽的代谢过程（补充图S3a）。在细胞成分（CC）中，DAPs主要在核糖体和细胞质中受到调控（补充图S3b）。在DAPs中富集的分子功能（MF）包括未折叠蛋白质结合、结构分子活性、铜结合、ATP依赖的伴侣蛋白活性和GTP酶活性（补充图S3c）。还观察到2,4-D主要调节了碳代谢、氨基酸和丙酮酸生物合成、翻译和蛋白酶体活性的代谢途径（补充图S3d）。这些富集的途径表明，2,4-D在胚胎发生诱导的早期阶段触发了广泛的代谢和翻译重编程。

2,4 μM 2,4-D处理相对于0 μM对照下上调的DAPs中，翻译相关活动的增强支持了早期胚胎发生诱导期间的蛋白组重编程
在20 μM 2,4-D处理下相对于0 μM对照上调的DAPs中，富集分析显示翻译相关过程和核糖体生物生成占主导地位（图2）。在BP类别中，有两个术语达到显著性，即翻译和对热的响应（图2a）。这两个术语的基因比率值都很低。在CC类别（图2b）中，富集的术语主要与核糖体相关结构相关，包括核糖体、细胞质大核糖体亚单位和核仁。MF分析（图2c）显示mRNA结合、GTP结合和核糖体结构成分的富集，这些功能通常与翻译活性相关。此外，还识别出营养储存活性在富集术语中。KEGG通路分析（图2d）显示出一个显著富集的通路，即核糖体，其基因比率约为0.041，进一步证实了翻译相关蛋白质在上调组中的主导地位。

图2
20/0 μM 2,4-D比较中上调蛋白质的功能富集。GO和KEGG富集分析显示了在20 μM 2,4-D下相对于对照（0 μM）积累增加的蛋白质。气泡图显示了每个本体中富集最多的术语：(a) BP，(b) CC，(c) MF，(d) KEGG。气泡的大小和颜色反映了富集统计。

在200 μM 2,4-D下相对于20 μM下调的蛋白质的生物合成和发育途径的抑制
对于在200 μM 2,4-D下相对于20 μM下调的蛋白质，进行了GO和KEGG富集分析（图3）。在BP本体（图3a）中，显著缺失的术语包括核苷磷酸代谢（基因比率约为0.057）、羧酸生物合成过程（约0.05）、丝氨酸家族氨基酸代谢（约0.15）和硫化合物代谢（约0.057）。胚胎发育（约0.05）、细胞质翻译起始（约0.20）和对冷的响应（约0.05）也属于显著下调的过程。在CC类别（图3b）中，下调的蛋白质主要与细胞质（约0.025）、细胞质（约0.060）和细胞内解剖结构（约0.020）相关。与质外体、共质体和细胞连接相关的术语也有所减少（均>0.065）。在MF本体（图3c）中，观察到核糖核苷酸结合（约0.023）、GTP结合（约0.060）、翻译因子活性（约0.080）和离子结合（约0.020）的表达减少。KEGG通路分析（图3d）显示氨基酸生物合成（约0.114）、碳代谢（约0.100）和蛋白酶体（约0.200）的显著减少。核糖体通路也出现了下调。

图3
200/20 μM 2,4-D比较中下调蛋白质的功能富集。GO和KEGG富集分析显示了在超剂量2,4-D浓度（200 μM）下相对于最佳处理（20 μM）积累减少的蛋白质。气泡图显示了每个本体中富集最多的术语：(a) BP，(b) CC，(c) MF，(d) KEGG。气泡的大小和颜色反映了富集统计信息。在超过最佳生长素浓度时，缺氧响应蛋白的激活受到限制。在200/20对比中分析上调的蛋白质，发现其功能特征较为有限，富集主要局限于BP本体（图4）。在MF、CC或KEGG类别中未识别出显著术语。在BP本体中，富集的术语主要与缺氧反应相关，包括细胞对缺氧的反应（约为0.0150），细胞对氧水平下降的反应（约为0.0065），以及对氧水平的反应（约为0.0151）。这些术语表明，在超过最佳浓度的2,4-D下上调的蛋白质集合主要与缺氧相关过程相关。所有在三个对比中识别的显著GO和KEGG术语的完整列表，包括完整的BP、CC、MF和途径类别，见补充表S3。

图4：200/20 μM 2,4-D对比中上调蛋白质的功能富集。只有BP术语达到显著性，而CC、MF或KEGG未检测到富集。气泡的大小和颜色反映了富集度量。富集的BP术语表明在超过最佳生长素浓度时与缺氧相关的反应。聚类分析显示，2,4-D诱导了六种剂量依赖的蛋白质积累模式。使用MFUZZ算法进行的聚类分析揭示了在C. papaya来自合子胚胎的外殖体上应用不同2,4-D浓度时出现的六种不同的蛋白质积累模式（图5）。这些簇代表了剂量敏感的调节谱型，突出了生长素在体细胞胚胎发生诱导期间触发的蛋白质组重编程。簇1包含68种蛋白质，在无2,4-D的情况下积累量较低，随后在所有2,4-D浓度下保持持续增加。簇2包含44种蛋白质，表现出波动的表达模式，在不同处理下的丰度变化较大，并在最高生长素浓度下有明显的峰值。簇3包含204种蛋白质，在对照组和较低的生长素浓度（0.2和2 μM）下保持高丰度，在20 μM时稳定，但在200 μM时显著下降。簇4包含110种蛋白质，随着生长素浓度从0增加到200 μM，丰度逐渐减少。簇5包含107种蛋白质，呈现出钟形模式，在无2,4-D时积累量低，在0.2、2和20 μM时丰度增加，在200 μM时强烈抑制。最后，簇6包含193种蛋白质，在无2,4-D时丰度高，但随着浓度增加逐渐减少，最终在200 μM时强烈抑制。总体而言，簇3、4、5和6代表了大多数差异表达蛋白（DAPs），在200 μM 2,4-D下表现为抑制，而簇1和5在中间生长素浓度下显示出特定的蛋白质积累，特别是在20 μM时。这些不同的积累谱型强调了2,4-D对番木瓜外殖体蛋白质组的剂量依赖性调节。

图5：C. papaya外殖体对2,4-D的剂量依赖性蛋白质组学反应。DAPs的聚类分析显示了在2,4-D浓度梯度上的不同反应模式。簇1和2显示出蛋白质积累增加，而簇3、4和6则显示出积累减少。簇5在中间剂量下显示出独特的反应。对2,4-D响应的转录因子和差异积累蛋白质的调控网络分析表明，2,4-D的影响与调节蛋白（如转录因子和染色质重塑蛋白）的调节密切相关。在蛋白质组数据集中鉴定出八种调节蛋白（表1）。其中三种蛋白在至少一种2,4-D处理下表现出差异积累，如其聚类分配所示（图5）。这些包括组蛋白去乙酰化酶（HDT3；evm.model.supercontig_5.85）（簇3）以及两种假定含有Cold shock结构域的转录因子（CSP3；evm.model.supercontig_6.261和CSP4；evm.model.supercontig_37.170）和含有Zinc finger CCCH结构域的蛋白52（MPH15.13；evm.modelSUPERcontig_235.5）（簇5）。通过分析20 μM（胚胎发生性愈伤组织诱导的最佳浓度）和200 μM（抑制胚胎发生能力）2,4-D之间的DAPs的调控功能，能够识别出可能与2,4-D介导的胚胎发生性愈伤组织诱导相关的其他蛋白质（表2）。这些候选蛋白可能参与对生长素浓度梯度的转录调控和信号级联反应。

表1：蛋白质组分析中鉴定的转录调节因子列表

表2：与C. papaya胚胎发生性愈伤组织诱导相关的由2,4-D差异积累的蛋白质列表

鉴于2,4-D处理对外殖体蛋白质组产生的广泛影响，我们搜索了DAPs之间的预测蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。这项分析产生了一个包含630个节点和3605条边的网络，从而能够研究对2,4-D响应的蛋白质相互作用模块（补充图S4）。此外，我们将聚类分析数据整合到预测的相互作用网络中，以可视化在特定2,4-D浓度下共积累的蛋白质可能调控的生物过程。在构建所有DAPs之间的预测相互作用网络后，应用MCODE算法来识别可能以剂量依赖方式被2,4-D调控的高度相互连接的节点。因此，识别出19个复合体，每个复合体都包含在特定生物过程中富集的DAP组（补充图S5）。这些模块中的每一个都显示了与2,4-D调控的特定途径相关的蛋白质之间的预测相互作用，其中最大的复合体与基因表达、蛋白酶体介导的蛋白质降解、能量代谢、蛋白质折叠和小分子代谢过程相关。此外，这些蛋白质形成了连接激素反应效应因子、转录调控、蛋白质翻译和能量代谢的相互连接网络（补充图S6）。图6展示了一个高置信度的PPI子网络，突出了这些枢纽蛋白及其相关的功能组。

图6：通过与2,4-D在C. papaya中诱导的胚胎发生性愈伤组织相关的蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用网络。该网络是在Cytoscape中使用stringApp生成的，置信度截止值为0.7。边以置信度视图显示，边的粗细和不透明度随STRING组合得分变化。名称表示通过STRING分析在C. papaya中鉴定出的拟南芥蛋白质的orthologues。网络是使用表2中列出的DAPs和从完整PPI网络中提取的第一个邻居构建的（补充图S4）。节点颜色代表聚类分析（mfuzz）上的ortholog分类：黄色（簇1）、橙色（簇2）、浅蓝色（簇3）、蓝色（簇4）、绿色（簇5）和粉色（簇6）。带有红色名称的节点代表在C. papaya DAPs中存在的拟南芥的重复orthologs，它们可能存在于多个簇中。

在此背景下，在完整的相互作用网络中预测的十个枢纽蛋白是核糖体蛋白，包括RPS6B（evm.model.supercontig_209.28）、RPS28C（evm.model.supercontig_1.384）、RPS3AA（evm.model.supercontig_58.59）、RPS5A（evm.modelSUPERcontig_103.75）、RPS7A（evm.model_supercontig_3.500）、RPS8B（evm.model(supercontig_12.207）、RPS10C（evm.modelSUPERcontig_107.113）、RPS7B（evm.model.supercontig_2.174）和RPL4A（evm.model.supercontig_10.79）。在对DAPs进行功能注释、转录调节因子预测和网络整合后，我们建立了一组与2,4-D诱导的胚胎发生性愈伤组织相关的DAPs列表（表2）。这些DAPs参与多种生物过程，预测的PPI涉及表观遗传调控（SAHH1；evm.model(supercontig_157.46）、激素响应（EBP1；evm.model_supercontig_120.60）、应激响应（HSP70-4；evm.model_supercontig_1.398）和蛋白酶体介导的降解（RPN10；evm.model.supercontig_37.159和SKP1A；evm.model_supercontig_26.289）（图6）。此外，还在受2,4-D调控的蛋白质中识别出了涉及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）代谢（METK3；evm.model_supercontig_102.23、METK4；evm.model_supercontig_146.36、SAM2；evm.model_supercontig_67.71和SAHH1；evm.model_supercontig_157.46）、细胞分裂和蛋白酶体功能（CDC48D；evm.model_supercontig_65.33、RPN10；evm.model.supercontig_37.159和evm.model_supercontig_6.273、RPN6；evm.model_supercontig_83.90、RPN8A；evm.model_supercontig_163.7和RPT3-2；evm.model_supercontig_2.273）以及生长素相关伴侣蛋白（P23-1；evm.model_supercontig_9.223）的相互作用。

讨论：正如预期的那样，没有2,4-D的合子胚胎表现出正常的发芽和根尖伸出（图1b），而中间剂量（0.2和2 μM）部分抑制了这些过程，但没有诱导出可见的愈伤组织形成（图1c-d；补充图S1）。相反，20 μM 2,4-D完全抑制了根尖伸长和发芽，导致在第14天出现胚胎发生性愈伤组织（图1e；补充图S1）。在最高的2,4-D浓度（200 μM）下，愈伤组织的形成延迟到第21天，且形成的愈伤组织缺乏典型的胚胎发生特征，表明其发育潜力受损（图1f；补充图S1）。总体而言，这些发现支持这样一个概念：获得胚胎发生能力需要一个最佳的生长素窗口，而超过最佳剂量的生长素会引发应激，破坏激素平衡，并损害胚胎发生的转录程序（Karami和Saidi 2010；Méndez-Hernández等人2021）。过量的生长素已被证明会激活氧化应激和渗透压应激途径，干扰细胞周期进展，促进无组织的愈伤组织形成而不是协调的胚胎发生发育（Fehér 2015；Pasternak等人2005）。对暴露于逐渐增加的2,4-D浓度的C. papaya外殖体的蛋白质组分析显示，与质子转运相关的蛋白质发生了剂量依赖的变化，尤其是在V-H?-ATPase和P-H?-ATPase家族中。在DAPs（表2）中，我们鉴定了液泡H?-ATPase亚基VHA-C（evm.model_supercontig_70.83）和VHA-E1（evm.model_supercontig_122.22），两者在中间生长素浓度下积累最多，而在超过最佳浓度时显著下降，而VHA-G1（evm.model_supercontig_666.2）和VHA-H（evm.model_supercontig_43.106）相对稳定。生长素激活的血浆膜H?-ATPase与胚胎和根发育过程中的细胞伸长过程一致相关（Rober-Kleber等人2003）。机制上，这种激活涉及泵的磷酸化及其与14-3-3蛋白的相互作用，如黄瓜（Li等人2020）和水稻（Wang等人2021）中所展示的。支持14-3-3蛋白在应激下的功能作用的是，在Malus×domestica愈伤组织中过表达MdGRF6（一种14-3-3基因）导致了对盐胁迫的敏感性增加，表明特定的14-3-3异构体可以通过与膜蛋白（如H?-ATPase）的相互作用来负面调节应激耐受性（Zhu等人2023）。激素之间的相互作用在调节H?-ATPase活性中起着关键作用，因为生长素促进其激活，而脱落酸（ABA）通过阻止14-3-3蛋白的结合来抑制它，如拟南芥中所观察到的（Xue等人2018）。鉴于pH调节在生长素介导的细胞壁松弛和信号传导中的核心作用（Spartz等人2014），在200 μM 2,4-D下这些ATPase的减少可能反映了与生长素信号传导和pH调节相关的细胞过程的变化。因此，超过最佳剂量的生长素完全抑制了外殖体的生长，并抑制了参与能量代谢、应激适应和胚胎发生的关键蛋白质。总体而言，这些发现表明过量的2,4-D与与质子泵活性和细胞能量代谢相关的蛋白质变化有关，这可能干扰了胚胎发生能力所需的分子途径。与这些观察结果一致的是，在最佳20 μM 2,4-D处理下上调的蛋白质在翻译、核糖体生物发生、mRNA结合和GTP结合功能方面显著富集（图2）。这些富集的类别加强了这样的解释：适度的生长素水平刺激翻译能力，并启动早期细胞重编程所需的代谢调整。核糖体相关术语的占优势表明20 μM剂量激活了维持体细胞胚胎发生初期步骤所需的蛋白质合成机制。这进一步加强了C. papaya的SE诱导高度依赖于生长素敏感性和生长促进信号与应激缓解信号之间精细平衡的观点。

除了调节质子泵外，蛋白质组分析还进一步揭示了蛋白质激酶和磷酸酶的变化，以及泛素-蛋白酶体系统的组成部分，其变化也是剂量依赖的。其中，SKP1样蛋白1A（SKP1A；evm.modelSUPERcontig_26.289）在簇4中，随着生长素浓度的增加，其丰度逐渐减少；SKP1样蛋白1B（SKP1B；evm.model_supercontig_20.89，簇6，和evm.model.supercontig_6.295，簇4）表明在调节早期细胞重编程的生长素响应信号转导途径中起关键作用。值得注意的是，簇4中的蛋白质随着2,4-D浓度的增加而减少，而簇6中的蛋白质在中间浓度下积累随后在200 μM时受到抑制（图5）。这种双相模式表明了生长素感知和信号传导机制的剂量敏感调节，这可能反映了获得胚胎发生能力所需的严格时间控制（Radoeva和Weijers 2014）。SKP1B在200/20 μM 2,4-D对比中保持不变，显示出在较低至中间生长素剂量下相对稳定，在最高剂量下显著减少。同样，SKP1样蛋白1A在这种对比中也保持不变，但随着生长素的增加其丰度逐渐减少，并且在其他对比中显示出差异积累（补充表S1）。Cullin相关NEDD8解离蛋白1（CAND1；evm.model_supercontig_173.13）显著下调，并随着生长素的增加而呈逐渐下降的趋势。此外，SKP1A、SKP1B和CAND1在PPI分析中显示出预测的相互作用（图6）。这些模式共同表明，在特定生长素条件下SCF复合体组分的减弱，可能限制了AUX/IAA的周转，并在超过最佳剂量时调节生长素信号输出。这些趋势表明，适量的2,4-D有利于SCF复合体的正确组装或激活，而过高的浓度可能会破坏这种平衡。这与先前的研究结果一致，即生长素的稳态和信号传导必须受到严格控制，才能获得胚胎发生能力（Staswick等人，2005年；Méndez-Hernández等人，2019年）。据知，SCF复合体与泛素-蛋白酶体系统和其他翻译后调节因子相互作用，形成一个对激素波动有反应的动态蛋白质稳态网络（Zhang和Zeng，2020年）。在这方面，对DAPs的完整蛋白质相互作用网络（PPI）中枢纽蛋白的搜索显示，核糖体蛋白在2,4-D诱导的变化中起着重要作用（补充图S6），突出了与愈伤组织形成相关的基因重编程。我们提出，最佳的2,4-D剂量能够精细调节SCF介导的AUX/IAA抑制因子的降解，而过量的生长素可能会损害这一过程，导致异常的生长素反应和降低的胚胎发生潜力。在200 μM 2,4-D下观察到的全局抑制现象，还得到了参与氨基酸生物合成、碳代谢、翻译起始和蛋白酶体活性的蛋白质显著减少的支持（图3）。这些下调富集的类别凸显了在过高生长素条件下，基本的生物合成和发育途径的崩溃，这与蛋白质组学分析中观察到的抑制性代谢环境相吻合。这些代谢和发育的崩溃与先前的研究结果一致，即过高的生长素会破坏由ROP GTP酶介导的极性和模式形成机制，而这些机制对胚胎发育和方向性生长素运输至关重要（Chen等人，2014年）。此外，研究表明，高浓度的2,4-D还会加剧氧化应激，并损害其他物种（如Medicago truncatula）的体细胞胚胎发生（Or?owska和K?pczyńska，2020年），进一步证实了过量生长素会使ROS稳态向有害状态转变的观点。由于ROS在适量的情况下促进分化，但在过量积累时则会损害发育能力（Prudente等人，2020年），我们数据集中检测到的生物合成、翻译和相关蛋白酶体途径的显著抑制很可能反映了向应激主导的细胞状态的转变。相反，在200 μM条件下上调的蛋白质集则显示出完全不同的功能特征（图4）。虽然在200 μM 2,4-D下下调的蛋白质主要与生物合成和翻译功能相关，但在这种条件下上调的蛋白质则专门富集与缺氧和缺氧相关的生物学过程术语。这种狭窄的功能激活表明，在过高的生长素水平下，外植体更倾向于缓解应激，而不是进行发育重编程，这加强了过量生长素使细胞环境向应激主导状态转变的观点。这一解释与证据一致，即缺氧信号与生长素、氧化还原平衡和能量代谢紧密相关（Renziehausen等人，2025年）。此外，研究表明2,4-D暴露还会减少非植物系统的氧气消耗（Barbieri，2009年），支持了过量生长素会破坏有氧代谢的假设。结合蛋白酶体组分的下调，这些变化进一步证实了过量2,4-D会损害蛋白质稳态、氧气平衡和细胞稳态，最终影响胚胎发生能力的获得。生长素信号传导本质上依赖于蛋白水解，通常是通过SCF-TIR1/AFB介导的AUX/IAA抑制因子的降解来激活转录。新的证据还表明，生长素还会促进其他信号组分的周转，揭示了泛素-蛋白酶体系统（UPS）在生长素驱动的细胞重编程中更广泛和综合的作用（De Roij等人，2024年）。在我们的研究中，暴露于逐渐增加的2,4-D浓度的外植体的蛋白质组学分析显示，参与蛋白质稳态的蛋白质出现了明显的剂量依赖性调节，特别是26S蛋白酶体的组分，以及几个预测的相互作用，形成了一个分子复合体（补充图S5b）。大多数蛋白质在基础水平上含量较低，随后随着生长素浓度的增加而逐渐积累，这表明早期存在蛋白水解激活阶段，与生长素感知一致。这种高剂量抑制的亚基与情境依赖性反应物之间的分离加强了这样的观点：在中等生长素条件下，蛋白酶体活性得到积极维持，支持AUX/IAA的周转和转录重编程，但在过高剂量下则被抑制，导致对胚胎发生能力有害的蛋白质组不平衡。这种剂量敏感性行为与C. canephora中的研究发现一致，即过高的生长素水平在体细胞胚胎发生期间破坏了蛋白酶体的完整性（Quintana-Escobar等人，2023年）。此外，生长素还促进了SCFTIR1与AUX/IAA抑制因子之间的相互作用，触发它们的泛素化及随后的降解，这对于生长素诱导的基因激活至关重要（Dos Santos Maraschin等人，2009年）。因此，SCFTIR1组分的突变稳定了AUX/IAA抑制因子并阻塞了生长素反应，证实了蛋白酶体介导的降解在生长素信号传导中的核心作用（Dos Santos Maraschin等人，2009年）。综上所述，适量的2,4-D处理与胚胎发生诱导期间蛋白质稳态和转录重编程相关的蛋白酶体活性模式相关，而高剂量则与蛋白酶体组分的减少相关，这可能干扰蛋白质稳态和生长素相关的调节过程。在获得胚胎发生能力的过程中，我们的数据集中检测到了14-3-3（GF14）蛋白家族的多个成员，它们在各种生长素处理下的丰度谱各不相同。在200/20 μM 2,4-D的对比中，几种异构体表现出抑制谱，包括通用调节因子8（GRF8；evm.model supercontig_309.6）和通用调节因子2（GRF2；evm.model.supercontig_36.169），它们在基础水平上含量较高，随后逐渐下调，表明对高生长素浓度敏感。相比之下，通用调节因子12（GRF12；evm.modelSUPERcontig_1.1152）和通用调节因子3（GRF3；evm.model.supercontig_179.17）在这个对比中保持不变，但在其他对比中积累减少（补充表S1），表明在不同的生长素条件下有更广泛的调节作用。此外，通用调节因子11（GRF11；evm.modelSUPERcontig_36.140）在这个对比中保持不变，但在另一个对比中积累更多，表明可能在细胞重编程的早期或中间阶段发挥作用。还预测到了这些异构体之间的相互作用（图6）。这些通用调节因子的调节与Coffea canephora中的先前研究结果一致，在那里多个14-3-3蛋白在体细胞胚胎发生诱导阶段与其他调节因子（如PP2A、SERK1、MADS-box转录因子和calreticulin）一起积累（Quintana-Escobar等人，2023年）。与此一致的是，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A调节亚基A2（PP2AA1；evm.model.supercontig_13.7）在200/20 μM 2,4-D处理对比中显著下调。同一簇中的另外两种磷酸酶PP2A4（evm.modelSUPERcontig_85.31）和PP2AA2（evm.model.supercontig_1.195）在这个特定对比中保持不变，但在较低的生长素水平下表现出集群3的特征性丰度。这些发现表明，通用调节因子（14-3-3蛋白）和PP2A相关组分可能作为保守的调节因子，支持激素和应激相关信号调节的调整，从而帮助获得胚胎发生能力。在体细胞胚胎发生的早期阶段，生长素相关的调节过程在决定细胞命运中起着重要作用。在我们的数据集中，2,4-D的应用导致酶Probable indole-3-acetic acid-amido synthetase（GH3.1；evm.model.supercontig_292.1）的强烈且一致的积累，它在200/20 μM 2,4-D对比中上调，并在其他对比中持续积累，表明其在整个剂量响应曲线中起着稳健和持续的作用。相比之下，GH3.3（evm.model.supercontig_6.74）在200/20 μM处理中保持不变，但在其他对比中上调，表明它在其他生长素条件下在缓冲生长素方面发挥更稳定的作用。GH3酶催化indole-3-acetic acid（IAA）的结合，将IAA结合到氨基酸上，从而减少自由生长素的量，有效地缓冲其细胞效应（Staswick等人，2005年）。这种结合机制已被证明会负调节生长素反应，如根尖伸长和芽细胞扩张（Nakazawa等人，2001年），这与我们在2,4-D处理的外植体中观察到的根系发育受到抑制的结果一致（图1）。在C. papaya中，GH3蛋白的积累也与特定光照条件下的体细胞胚胎成熟有关（Almeida等人，2019年）以及C. canephora中的体细胞胚胎发生进展有关（Méndez-Hernández等人，2021年；Quintana-Escobar等人，2023年）。总的来说，这些发现表明，GH3介导的生长素结合与不同2,4-D处理下的早期胚胎发生重编程期间的生长素相关调节调整有关。根尖生长的抑制和生长素响应蛋白的调节表明，通过结合进行的生长素解毒不仅是一种稳态机制，也是体细胞胚胎发生期间细胞重编程的先决条件。同样，参与S-腺苷甲基化（SAM）代谢的蛋白质也表现出明显的剂量依赖性变化。METK4（evm.model(supercontig_146.36）随着生长素浓度的增加而逐渐减少，特别是在200/20对比中显著抑制（表2）。这种模式与集群4的功能谱相符，其中甲基供体的生物合成在过高生长素下逐渐受到抑制。尽管SAM2（evm.model(supercontig_67.71）和METK3（evm.modelSUPERcontig_102.23）在这个特定对比中保持不变，但它们在其他对比中一致下调，而SAM2（evm.model(supercontig_48.212）在所有处理中保持稳定的丰度，表明它在体细胞胚胎发生期间维持基础SAM水平方面起着构成性作用（补充表S1）。在高生长素浓度下SAM生物合成的这种抑制进一步加剧了Adenosylhomocysteinase 1（SAHH1；evm.model.supercontig_157.46）的变化，后者属于集群3，在较低的生长素水平下保持高丰度，但在200 μM 2,4-D时急剧下降。SAM代谢形成了一组具有预测相互作用的蛋白质，其中SAHH1是一个枢纽（图6）。支持这一功能联系的是，在甘蔗体细胞胚胎成熟期间报告了SAHH与SAM合成酶之间的相互作用（Xavier等人，2022年），其中SAHH（与A. thaliana的HOG1同源）被证明与SAM1和SAM2在一个甲基化相关的蛋白质网络中相关。在A. thaliana中，HOG1对于DNA甲基化依赖的基因沉默是必需的（Rocha等人，2005年），并编码一种SAH水解酶，确保通过SAM合成酶生成的SAH的可用性（Ouyang等人，2012年）。尽管SAM合成酶在生长素依赖性方面的表现有所不同，但对其解释必须考虑体细胞胚胎发生的更广泛表观遗传背景。几项研究表明，减少的甲基化能力可以促进细胞去分化并获得胚胎发生能力，通常是通过染色质的松弛和发育调节因子的重新激活（Fraga等人，2012年；Nic-Can等人，2013年；Xu和Huang，2014年；Fehér，2015年）。相反，其他系统依赖于维持甲基团的可用性来稳定新建立的胚胎发生程序（Neves等人，2021年）。总之，这些发现表明SAM/SAH循环作为一个动态的调节节点，其影响取决于物种、背景和阶段，将生长素等激素输入与调节发育可塑性的表观遗传机制相结合。组蛋白修饰作为一个额外的调节层显现出来。组蛋白去乙酰化酶3（HDT3；evm.model_supercontig_5.85）在200/20 μM对比中受到强烈抑制，而另一个HDT3同源物（evm.model_supercontig_599.1）在涉及200 μM 2,4-D的对比中一致下调。HDACs通过抑制分化相关基因来促进去分化和获得胚胎发生能力（Hollender和Liu，2008年；De-la-Pe?a等人，2015年；Sena等人，2024年）。在A. thaliana中，HDA6和HDA19在种子萌发后限制胚胎程序，表明HDACs在特定条件下也可以限制再生或胚胎发生潜力（Tanaka等人，2008年）。相反，由组蛋白乙酰转移酶或HDAC抑制介导的组蛋白乙酰化增加与增强重编程能力相关（Grzybkowska等人，2018年；Kim等人，2018年）。更广泛的表观遗传分析表明，生长素诱导的体细胞胚胎发生涉及广泛的染色质重塑，包括组蛋白乙酰化、DNA甲基化和miRNA介导的调节（Wójcik等人，2020年；Wójcikowska等人，2020年）。DNA甲基化途径也在体细胞胚胎发生中起着关键和复杂的作用，维持性和从头甲基化都对调节体细胞胚胎发生相关的转录因子有贡献，这从DNA甲基化突变体和5-AzaC处理培养物中LEC1、LEC2和BBM的表达变化中可以得到证实（Grzybkowska等人，2018年）。总体而言，这些证据支持这样的解释：在过高生长素条件下，HDAC的抑制整合了激素和基于染色质的机制，可能削弱了有效的体细胞胚胎诱导所需的表观遗传控制。这些发现共同表明，体胚诱导依赖于一个狭窄的 auxin（生长素）作用窗口期，在此期间信号传导、蛋白质稳态和染色质调控之间保持着平衡。本研究提供了一个机制框架，有助于改进基于 auxin 的愈伤组织诱导方案，不仅适用于番木瓜（C. papaya），也可能适用于其他采用体胚发生的植物系统。