蓝莓体外繁殖的优化：植物生长调节剂和培养基成分对繁殖及生根的影响

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Optimization of in vitro propagation of blueberry: influence of plant growth regulators and medium components on multiplication and rooting

　　摘要
蓝莓（Vaccinium sp.）是一种具有重大经济价值的果实，其繁殖效率直接影响苗木的可用性和生产规模。本研究旨在优化三种蓝莓品种（Bluegem、Climax和Woodard）的离体繁殖过程，具体通过提高枝条增殖率、确保均匀性以及改善生根效率和离体存活率，并评估关键的生理健康指标，重点关注增殖和生根阶段。在枝条增殖过程中，将茎段培养在添加了不同浓度2-异戊基亚腺嘌呤（2-ip）和腺嘌呤硫酸盐的木质植物培养基（WPM）中。2.5 mg L?1 2-ip与10 mg L?1腺嘌呤硫酸盐的组合对Bluegem和Climax产生了最高的枝条数量，而2.5 mg L?1 2-ip与20 mg L?1腺嘌呤硫酸盐的组合对Woodard最为有效。所有品种均表现出增强的枝条增殖和均匀性，从而促进了后续的微繁殖步骤。在生根阶段，首先用吲哚-3-丁酸（IBA）处理插条，然后将其转移至不同浓度（0–100%）的WPM培养基中，有时会添加活性炭。生根反应因品种而异：Bluegem在75% WPM条件下表现最佳，而活性炭仅对Climax有益。这些方案提高了生根率和离体存活率，有助于成功的移栽适应。总体而言，在每个繁殖阶段使用针对性的生长调节剂和优化的培养基成分，改善了蓝莓品种的增殖率、生根效率和离体适应能力。

引言
蓝莓（Vaccinium sp.）是一种属于杜鹃花科（Ericaceae）和越橘属（Vaccinium）的小型果实，原产于欧洲和北美，该作物具有重要的经济价值（Correia等人，2024年）。近年来，由于蓝莓的高营养价值，其全球产量显著增加（Fan等人，2017年）。越橘属包含约450个物种，主要分布在北半球的亚热带、温带和北方地区（Correia等人，2024年）。传统上，蓝莓通过扦插进行无性繁殖；然而，这种方法通常效率较低，无法满足对高质量种植材料日益增长的需求，也无法快速将新品种引入市场（Fan等人，2017年）。在这种情况下，离体繁殖或微繁殖成为一种重要的替代方法。这种在控制和无菌条件下进行的技术可以实现全年快速的无病毒、基因均匀的植物克隆繁殖（Debnath和Goyali，2020年；Ahmad和Faisal，2018年）。组织培养方案也有助于其他果树维持遗传完整性并加速结果（Ahmad和Faisal，2018年）。有效的蓝莓微繁殖依赖于增殖和生根阶段的优化。通过调整培养基组成，特别是添加植物生长调节剂（如2-异戊基亚腺嘌呤（2-ip）和腺嘌呤硫酸盐），可以增强枝条增殖。腺嘌呤硫酸盐是一种生长调节剂，能促进离体细胞分裂。它是一种基于嘌呤的细胞分裂前体，能促进细胞分裂和枝条增殖（Amoran等人，2025年）。这些调节剂的浓度和平衡对于刺激所需的器官形成（无论是枝条、根还是愈伤组织）至关重要；然而，最佳条件可能因物种和品种而异（Suman，2017年；Welander等人，2017年）。这种已知的品种特异性差异凸显了一个关键的知识空白：缺乏针对个别具有重要商业价值的蓝莓品种的详细优化方案，这些方案对于最大化繁殖效率和成功移栽适应至关重要。

同样重要的是生根阶段，这在木本植物（如蓝莓）中常常存在挑战。Vaccinium sp.的根再生取决于基因型对生根因素的敏感性以及所采用的培养技术，包括生长素类型（如吲哚-3-丁酸（IBA）的添加、活性炭的补充以及培养基的矿物质组成和浓度（Erst等人，2018b；Tejada-Alvarado等人，2022年）。成功的离体生根和随后的移栽适应对于建立健壮健康的蓝莓植株至关重要；因此，必须调整方案以最大化生根效率和植株存活率（Arruda等人，2017年）。为了全面评估植株质量并预测移栽适应成功，本研究还纳入了关键的生理分析。测量了光合色素（叶绿素a、b、总叶绿素和类胡萝卜素）作为植物光合能力的直接指标，这对能量生产和离体独立生长至关重要。相对含水量（RWC）是评估植物水分状况及其水分平衡能力的关键指标，在向离体条件过渡期间这一点尤为重要。此外，还评估了电解质泄漏情况，以确定膜完整性，这是细胞健康和耐受性的敏感指标，因为受损的膜会显著阻碍生理功能并降低存活率。这些生理参数，连同形态和遗传稳定性评估，对于开发真正优化的优质蓝莓植株微繁殖方案至关重要。

鉴于这些考虑，本研究旨在通过评估植物生长调节剂和培养基成分对组织培养增殖和生根阶段的影响，优化三种蓝莓品种的离体繁殖。本研究旨在为大规模繁殖和更高质量的离体植物提供改进的方案，支持蓝莓种植业的扩展和生产力。在此背景下，我们对“优化”的定义包括最大化关键性能指标，如枝条增殖率、植株均匀性、根的数量和长度、鲜重和干重、光合色素含量，以及至关重要的离体存活率，同时保持遗传稳定性和膜完整性。最终目标是确定能够全面提高这些关键阶段微繁殖效率和成功的品种特定条件。

材料与方法
蓝莓品种Bluegem、Climax和Woodard的植物材料作为已建立的离体培养物获得。这些初始库存培养物按照De Souza等人（2025年）描述的方案，每隔30天转接四次到木质植物培养基（WPM）中，其中添加了2.5 mg L?1 2-ip。为了优化后续的增殖和生根阶段，本研究中没有重新评估原始外植体的离体建立情况。材料在人工光照的生长室中维持，光照由白色LED灯提供，平均辐照度为49.4 μmol m2 s?1，光照周期为16小时，温度为25±2°C。实验分为两部分：首先进行离体增殖，然后进行蓝莓植物的离体生根。两项实验均在巴西米纳斯吉拉斯州拉夫拉斯市（Lavras，44°57’50”W，21°13’40”S，海拔919米）联邦大学（UFLA）的农业系（DAG）的植物组织培养实验室进行。

离体蓝莓增殖
将三种蓝莓品种的茎段（约1.5厘米长）转移到含有不同浓度2-ip（0和2.5 mg L?1）和腺嘌呤硫酸盐（0、10、20和40 mg L?1）的15 mL WPM培养基的试管中。选择0和2.5 mg L?1 2-ip是基于先前研究和文献（Debnath，2007年；Ostrolocká等人，2004年；Reed和Abdelnour-Esquível，1991年）的结果，这些研究表明2.5 mg L?1是Vaccinium物种中有效的增殖浓度，0 mg L?1作为对照用于评估基础增殖。这种方法允许重点优化2-ip和腺嘌呤硫酸盐之间的协同效应。然后将材料在相同的条件下保持在生长室中60天。

分析
评估了植株长度、节间长度、叶片数量、叶片长度、枝条数量、枝条长度以及植株的鲜重和干重。使用数字卡尺测量每个植株的枝条长度、节间和叶片。使用精密分析天平进行鲜重和干重测量。然后将植株放入40°C的强制通风烤箱中，直到达到恒定重量，以尽量减少氧化和热降解过程，从而确保样品的生理和生化特性的准确性（Taiz和Zeiger，2017年）。

光合色素
将新鲜的蓝莓叶片（0.025克）细切并转移到含5 mL 80%丙酮的Falcon试管中用于提取光合色素。试管用铝箔包裹以防止光照和可能的叶绿素降解。在±4°C的冰箱中放置24小时后，以3000 rpm的速度离心10分钟以去除植物残渣。然后使用Elisa Multiskan GO分光光度计（Thermo Fisher Scientific）在470、645、652和663纳米波长下测量吸光度（Scopel等人，2011年）。分析重复三次，每个处理重复四次，使用Skanit Software 5.0 for Microplate Readers RE版本5.0.0.42。叶绿素a、b、总叶绿素和类胡萝卜素的计算采用Li等人（2013年）提出的公式。

相对含水量
为了评估相对含水量（RWC），从两片最年轻的、完全展开的叶片中提取直径为6毫米、面积为28.27平方毫米的叶片圆片。称量这些圆片的鲜重（FM）。随后，将这些圆片浸入去离子水中24小时。之后再次称量以确定其膨胀重量（TM）。然后在有强制空气循环的烤箱中以70°C干燥48小时，称得干重（DM）。使用Barrs和Weatherley（1962年）提出的公式计算RWC：
$$\:RWC\:\left(\%\right)=\frac{\left(FM-DM\right)}{(TM-DM)}\:\times\:100$$
其中：FM = 鲜重（克）。TM = 膨胀重量（克）。DM = 干重（克）。

电解质渗漏和膜完整性
从最年轻的、完全展开的叶片中取六个直径为6毫米、面积为28.27平方毫米的叶片圆片，放入含有15 mL去离子水的试管中，每种处理六个试管。将试管放在室温下的摇床上进行24小时。之后，测量溶液的自由电导率（FEC）。随后，将试管放入100°C的水浴中1小时以测量溶液的总电导率（TEC）。使用Shi等人（2006年）提出的公式计算电解质泄漏（EL）率：
$$\:EL\left(\%\right)=\frac{FEC}{TEC}\times\:100$$
其中：FEC = 自由电导率（dS m?1）；TEC = 总电导率（dS m?1）。

膜完整性（MI）通过电解质泄漏来估计，使用电导率计测量。膜完整性使用Azevedo等人（2008年）提出的公式计算：
$$\:MI\left(\%\right)=\left(1-\left(\frac{FEC}{TEC}\right)\right)\times\:100$$

流式细胞术
为了测定DNA含量，将50毫克蓝莓叶片组织用手术刀在含有1 mL Marie缓冲液（Marie和Brown，1993年）的Petri皿中切碎以进行核提取。然后使用Pasteur移液管吸取样品并通过50微米过滤器过滤。接下来，将悬浮液用25 μL的碘化丙啶溶液（1 mg/mL）进行染色。每个样本至少分析10,000个细胞核的荧光发射情况，并且读数重复三次。分析使用的是BD FACSCalibur 4色流式细胞仪（Becton Dickinson公司生产）。统计直方图是用CellQuest软件生成的。所使用的参考标准是Vicia faba cv. Inovec（26.90 pg）。核DNA含量（pg）通过以下公式估算：DNA含量（pg）=（样本G1峰位置/V. faba G1峰位置）× 26.90。

### 实验设计与统计分析
实验涉及三个品种（Bluegem、Climax和Woodard），采用2×4因子方案，每种处理重复20次。本研究测试了两种浓度的2-ip（0和2.5 mg L?1）和四种浓度的硫酸腺嘌呤（0、10、20和40 mg L?1）。处理方式列在表1中。数据通过方差分析进行处理，并使用R Studio软件在5%的概率水平上进行了Scott-Knott检验。

### 体外蓝莓繁殖
将蓝莓插条（长度1.5厘米）转移到含有15毫升培养基的试管中，培养基中含水、5.5 g/L的琼脂和20 mg/L的IBA（Erst等人，2018a）。在之前描述的条件下一培养48小时。48小时后，将诱导出的插条转移到含有15毫升WPM培养基（浓度为0%、25%、50%、75%和100%）的试管中，这些培养基有的不含（0.0 g/L）活性炭，有的含有（2.0 g/L）活性炭。培养基的pH值为5.7±0.3，在121±1°C和1.05 atm的压力下高压灭菌20分钟，然后置于生长室中培养60天。

### 光合色素分析
体外生根的蓝莓植株的光合色素分析按照“光合色素”部分的方法进行。

### 实验设计与统计分析
实验涉及三个蓝莓品种（Bluegem、Climax和Woodard），使用20 mg/L的IBA，并预先测试了不同的IBA浓度。同时测试了五种不同百分比的WPM培养基（0%、25%、50%、75%和100%），有的培养基含有活性炭，有的不含。T1作为对照组，详细信息见表2。

### 实验设计
实验完全随机设计，采用5×2因子方案，使用了五种不同百分比的WPM培养基和两种浓度的活性炭。数据通过方差分析进行处理，均值使用统计软件SISVAR（Ferreira 2019）在5%的显著性水平上进行Scott-Knott检验。

### 结果
### 体外蓝莓繁殖
图1A、图1B和图1C展示了Bluegem（图1A）、Climax（图1B）和Woodard（图1C）品种在体外培养60天后对不同浓度硫酸腺嘌呤和2-ip的反应。

### 形态测量参数
对以下参数进行了评估：地上部分长度（毫米）、根长（毫米）、根数、叶片数、叶长（毫米）以及植物鲜重和干重（克）。分析使用了8个重复组。使用毫米尺测量地上部分和根的长度，使用精密分析天平测量鲜重和干重。然后将植株置于40°C的强制空气循环温室中，直到达到稳定重量。

### 光合色素分析
体外生根的蓝莓植株的光合色素分析按照“光合色素”部分的方法进行。

### 实验设计与统计分析
实验涉及三个蓝莓品种（Bluegem、Climax和Woodard），使用20 mg/L的IBA，并通过预测试确定了不同的IBA浓度。同时测试了五种不同百分比的WPM培养基（0%、25%、50%、75%和100%），有的培养基含有活性炭，有的不含。T1作为对照组，详细信息见表2。

### 结果
### 体外蓝莓繁殖
图1显示了Bluegem（图1A）、Climax（图1B）和Woodard（图1C）品种在体外培养60天后对不同浓度硫酸腺嘌呤（0、10、20和40 mg/L）和2-异戊烯基腺嘌呤（2-ip）（0和2.5 mg/L）的反应。

### 形态测量参数
对于Bluegem品种，不同处理组之间的植物长度、节间长度和分芽数量存在显著差异（表3）。在含有最低浓度硫酸腺嘌呤的处理组中，分株和节间长度有积极的表现。然而，在使用2-ip的处理组中未观察到显著差异。对于分芽数量，T6、T7和T8处理组表现较好。在不同处理组之间，叶片数、叶长、分株长度以及鲜重和干重没有显著差异（表3）。

### Climax品种
在Climax品种中，除叶片数和干重外，大多数形态参数存在显著差异（表4）。T6和T7处理组（含2.5 mg/L的2-ip）的分株数量显著增加，而不含2-ip的处理组（T1-T4）的分株数量最少（表4）。T1-T4处理组的植株长度和叶长通常最高。T3处理组的节间长度最为突出，T6处理组的鲜重积累最多（表4）。

### Woodard品种
对于Woodard品种，不同处理组之间的节间长度、叶长、分株数量、分株长度以及鲜重和干重存在显著差异（表5）。特别是分株长度，T1和T4处理组的分株长度最长（表5）。T1和T2处理组的节间长度最佳。T1、T2、T3和T4处理组的分叶数最多。T7处理组的分株数量增加较多。T1和T4处理组的分株长度也较长。T7处理组的鲜重积累最多，而T7和T8处理组的干重积累也最多（表5）。

### 光合色素
无论品种如何，光合色素的含量存在显著差异（表6）。

### 相对含水量
仅对于Woodard品种，不同处理组之间的相对含水量存在显著差异（表7）。然而，T6和T8处理组的相对含水量最低。其他品种之间没有显著差异（表7）。

### 电解质渗出
无论品种如何，不同处理组之间的电解质渗出情况没有显著差异（表8）。

### 膜完整性
对于Bluegem和Climax品种，不同处理组之间的膜完整性存在显著差异（表9）。Bluegem品种中，对照组（T1）的膜完整性最高（表9），而其他处理组（T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8）的膜完整性较低，表明添加2-ip和/或硫酸腺嘌呤影响了该品种的膜完整性。Climax品种中，T1和T4处理组的膜完整性最好（表9），而其他处理组（T2、T3、T5、T6、T7、T8）的膜完整性较低。

### 流式细胞术
进行了流式细胞术分析以确定所研究蓝莓品种的DNA含量。结果显示，各品种的DNA含量没有变化，Bluegem、Climax和Woodard的DNA含量分别为4.43、4.65和4.38 pg，根据获得的直方图（图2），可以推断它们在基因上是稳定的。此外，无论分析哪些品种，不同浓度的硫酸腺嘌呤和2-ip处理组之间也没有显著差异（图2）。

### 体外蓝莓生根
下图显示了Bluegem（图3A）、Climax（图3B）和Woodard（图3C）品种在IBA和不同浓度WPM培养基（0%、25%、50%、75%和100%）以及是否含有活性炭（0.0 g/L或2.0 g/L活性炭）相互作用下的表现。

### Bluegem品种的行为
下图展示了Bluegem（图3A）、Climax（图3B）和Woodard（图3C）品种在IBA和WPM培养基相互作用下的行为。

### Climax品种的行为
Bluegem（A）、Climax（B）和Woodard（C）品种在IBA和不同浓度WPM培养基（0%、25%、50%、75%和100%）以及是否含有活性炭（0.0 g/L或2.0 g/L活性炭）相互作用下的行为。

### Woodard品种的行为
不同处理组之间的节间长度、叶长、分株数量、分株长度以及鲜重和干重存在显著差异（表5）。特别是分株长度，T1和T4处理组的分株长度最长（表5），T2、T5、T6、T7和T8处理组处于中间水平，而T3处理组的节间长度最短。T1和T2处理组的叶片长度最佳。T1、T2、T3和T4处理组的叶片长度也较高。T7处理组的分株数量增加最多。T1和T4处理组的鲜重积累最多，而T7处理组的干重积累也最多。

### 光合色素
无论品种如何，光合色素的含量存在显著差异（表6）。根系发育（根长和根数）通过多种处理方式得到了优化（T3、T5、T6、T7、T8、T9），其中T5处理方式下的根长最为显著。对于叶长而言，T8和T10处理方式最为有效。对于Climax品种，除干重外，大多数参数也显示出显著差异。T9处理方式在枝条长度和叶片数量方面取得了最高数值。在含有不同沃氏培养基（WPM）浓度的活性炭的处理中（T2、T4、T6、T8），根长得到了有效改善。至于根数，T6和T8处理方式（均含有活性炭）尤其突出。叶长最佳的处理方式为T3、T6和T9，而新鲜质量的最佳处理方式为T6、T7和T9。

在Woodard品种中，几乎所有分析参数都显示出显著差异，枝条长度和根数除外。T7和T9处理方式对枝条长度最为有效。尽管根长和根数在统计上没有显著差异，但T6和T9处理方式记录的数值最高。叶片数量在多个处理组中均较高（T4、T6、T7、T8、T9、T10），其中T4处理组的叶片数量达到峰值。最终，T9处理方式在新鲜质量和干质量方面取得了最积极的结果。

**表10**：Bluegem、Climax和Woodard品种的植物长度、根长、根数、叶片数量及叶长的数据，涉及IBA与沃氏培养基浓度（0%、25%、50%、75%和100%）的相互作用，包括不含（0.0克/升）和含（2.0克/升）活性炭的情况。

**表11**：Bluegem、Climax和Woodard品种的新鲜质量和干质量数据，涉及IBA与沃氏培养基浓度（0%、25%、50%、75%和100%）的相互作用，包括不含（0.0克/升）和含（2.0克/升）活性炭的情况。

**光合色素**：
在光合色素的分析中，所研究的三个品种的所有分析参数均显示出处理方式之间的显著差异（表12）。在Bluegem品种中，T5和T7处理方式对所有分析变量均最为有效。在Climax品种中，T10处理方式在叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素含量方面表现最佳；而在叶绿素b方面，T4和T10处理方式更优。在Woodard品种中，T5、T6和T10处理方式在所有分析参数上均取得了最佳结果。

**表12**：Bluegem、Climax和Woodard品种的叶绿素a、b、总叶绿素和类胡萝卜素（毫克/克）数据，涉及IBA与沃氏培养基浓度（0%、25%、50%、75%和100%）的相互作用，包括不含（0.0克/升）和含（2.0克/升）活性炭的情况。

**存活率**：
在本研究中，观察到了种子苗在移至适应阶段后的体外生根过程的效率（表13）。

**讨论**：
蓝莓的微繁殖技术已应用超过四十年，每年都有新的进展来改进体外培养过程。这项技术被广泛使用，因为它能促进植物更快的营养生长、提早发育并提高产量（Molnar等人，2022年）。在蓝莓体外繁殖阶段最常用的细胞分裂素有玉米素和2-ip。多项研究表明，玉米素是促进更多枝条生长的调节剂（Wang等人，2023年）。另一方面，硫酸腺嘌呤也是一种促进更多枝条生长的调节剂，其效果类似于细胞分裂素。Ribeiro等人（2014年）报告称，当硫酸腺嘌呤与其他细胞分裂素联合使用时，可以促进枝条增殖并提高植物均匀性。因此，在本研究中，将2-ip与硫酸腺嘌呤结合使用的目的是利用它们的协同作用来促进枝条增殖和增强植物均匀性，鉴于硫酸腺嘌呤具有类似细胞分裂素的特性。

Cüce和S?kmen（2017年）评估了不同激素组合对越橘（Vaccinium uliginosum L.）体外芽生成的效应，发现含有1.0毫克/升玉米素、0.1毫克/升IBA和0.2毫克/升GA3的培养基能够产生最多的芽。在本研究中，使用2-ip和硫酸腺嘌呤组合的培养基对Bluegem品种的芽生成效果相似，但对Climax和Woodard品种则获得了更高的结果。这种特定品种的优化表明，单一通用方案往往不够，需要量身定制的方法来达到最大的增殖率。与Schuchovski和Biasi（2021年）的研究结果相比，本研究中三个品种的枝条数量均显著增加。这些研究者分析了Vaccinium virgatum ‘Delite’的微繁殖情况，使用了不同浓度的玉米素（0、2.5、5.0、7.5和10微摩尔），每个处理组每株植物产生一个芽。我们的研究发现，在‘Bluegem’、‘Climax’和‘Woodard’三个品种中，枝条数量显著增加（Climax在T6处理下达到5.83个芽，Woodard在T7处理下达到6.16个芽），这凸显了我们优化的2-ip和硫酸腺嘌呤组合的优越性。此外，大多数研究表明，与基于玉米素的方案相比，这些组合具有更高的枝条生成效果。

此外，本研究还发现三个品种的枝条数量均高于Schuchovski和Biasi（2021年）的研究结果。这些研究者分析了Vaccinium virgatum ‘Delite’的微繁殖情况，使用了不同浓度的玉米素（0、2.5、5.0、7.5和10微摩尔）。虽然我们的研究结果优于他们的，但这也表明针对特定品种的优化方案是必要的。在本研究中，对于这三个品种，枝条数量的增加也可能是由于优化了特定生长调节剂的组合。

在光合色素方面，所有分析参数都显示出处理方式之间的显著差异（表12）。在Bluegem品种中，T5和T7处理方式对所有分析变量均最为有效。在Climax品种中，T10处理方式在叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素含量方面表现最佳；而在叶绿素b方面，T4和T10处理方式更优。在Woodard品种中，T5、T6和T10处理方式在所有分析参数上均取得了最佳结果。

**存活率**：
在本研究中，观察到了体外生根苗在适应阶段的存活率（表13）。

**结论**：
蓝莓的微繁殖技术已经应用了四十年以上，每年都有新的进步。这项技术因其能促进植物更快的营养生长、提早发育和提高产量而得到广泛应用（Molnar等人，2022年）。在蓝莓体外繁殖阶段最常用的细胞分裂素有玉米素和2-ip。多项研究表明，玉米素是促进更多枝条生长的关键调节剂（Wang等人，2023年）。另一方面，硫酸腺嘌呤也被发现可以促进更多枝条的生长，因为它具有类似细胞分裂素的效果（Ribeiro等人，2014年）。在本研究中，将2-ip与硫酸腺嘌呤结合使用的目的是利用它们的协同作用来促进枝条增殖和增强植物均匀性。

Cüce和S?kmen（2017年）评估了不同激素组合对越橘（Vaccinium uliginosum L.）体外芽生成的影响，发现含有1.0毫克/升玉米素、0.1毫克/升IBA和0.2毫克/升GA3的培养基产生了最多的芽。在本研究中，使用2-ip和硫酸腺嘌呤组合的培养基对Bluegem品种的芽生成效果与前者相似，但对Climax和Woodard品种效果更好。具体而言，2.5毫克/升2-ip与10毫克/升硫酸腺嘌呤的组合对Bluegem和Climax最为有效，而2.5毫克/升2-ip与20毫克/升硫酸腺嘌呤的组合对Woodard最为有效。这种针对特定品种的优化表明，单一通用方案往往不够，需要根据不同品种制定个性化方案以达到最佳增殖率。

本研究还观察到三个品种的枝条数量均高于Schuchovski和Biasi（2021年）的研究结果。这些研究者研究了Vaccinium virgatum ‘Delite’的微繁殖情况，使用了不同浓度的玉米素（0、2.5、5.0、7.5和10微摩尔），每个处理组每株植物产生一个芽。我们的研究发现，‘Bluegem’、‘Climax’和‘Woodard’三个品种的枝条数量显著增加（Climax在T6处理下达到5.83个芽，Woodard在T7处理下达到6.16个芽），这表明我们优化的2-ip和硫酸腺嘌呤组合优于基于玉米素的方案。

此外，多数研究表明，玉米素比2-ip更能促进繁殖率。然而，本研究表明，硫酸腺嘌呤与2-ip的结合促进了更多枝条的生长和枝条大小的均匀性，这可能有利于后续的微繁殖过程。

光合色素是植物生理状态的重要指标，与植物的良好发育直接相关。这些色素负责促进光能在植物体内的吸收、转化和传输（Park等人，2018年）。Yavorska和Vorobets（2019年）研究了Vaccinium corymbosum L.（cv. Elliott）枝条中的光合色素，发现其叶绿素a含量为0.16毫克/克，叶绿素b含量为0.08毫克/克，总叶绿素含量为0.25毫克/克，类胡萝卜素含量为0.03毫克/克。本研究中所有品种的结果均优于这些作者的水平。本研究中光合色素含量的积极结果可能与叶片和枝条的数量及大小增加有关，这些因素增加了光合面积，从而促进了光合色素的生成。此外，细胞分裂素如2-ip和硫酸腺嘌呤被认为在维持叶绿体结构和功能、延缓叶片衰老以及促进光合蛋白合成方面起着直接作用。这种直接的激素效应，加上叶片面积的增加，可能有助于优化处理中观察到的更高光合色素积累。

水是植物良好生长和发育的关键因素，因此需要验证生长调节剂是否对其产生了负面影响。Climax和Bluegem品种的相对水分含量没有受到影响，而Woodard品种在某些处理下表现出更高的水分储存能力，表明其具有较好的水分吸收效率。

电解质外渗与细胞膜的完整性直接相关。细胞膜的完整性降低会损害其功能（Chattopadhyay等人，2011年）。本研究表明，蓝莓品种在电解质泄漏方面没有显著差异，说明2-ip和硫酸腺嘌呤的结合没有破坏细胞壁，导致电解质泄漏。相反，在Bluegem和Climax品种中，某些处理方式下细胞膜完整性显著降低，这可能表明特定浓度或组合的生长调节剂引起了细胞应激。这种应激可能导致活性氧（ROS）的产生，引发脂质过氧化，进而影响细胞膜的半透性，导致电解质泄漏增加。即使不立即致命，这种膜完整性的损害也可能影响营养吸收、信号传导和整体细胞稳态，从而影响后续的适应阶段。不同品种之间的差异反应突显了它们在应激耐受性和代谢调节方面的遗传差异。水分分析在本研究中非常重要，因为它表明2-ip和硫酸腺嘌呤的使用没有影响水分的吸收和分配。

在植物组织培养中，持续使用生长调节剂可能导致突变等不良事件，从而干扰植物材料的遗传完整性。流式细胞术是一种应用于多个领域的技术，包括植物育种，可用于确定DNA含量、倍性和基因重组。与其他方法相比，它具有更快的样本制备速度和更高的准确性，也被广泛用于验证材料的遗传稳定性（Zafar等人，2019年；Breeding 2022年）。

在本研究中，三种 Cultivation 在体外培养并暴露于硫酸腺嘌呤和2-ip浓度下的直方图峰值与对照组植物的直方图相似，表明DNA含量没有改变。这一因素对于保证分析材料的遗传完整性和保持植物初始特征至关重要，确保生成的植物与原始植物具有相同的遗传特性。

为了验证植物体外生根的成功与否，需要观察一些关键参数，如根的数量和长度以及体外生根率（Figiel-Kroczyńska等人，2022年）。在蓝莓培养的生根过程中，最常用的生长调节剂是IBA，因为它被认为是稳定的分子（Costa Junior等人，2018年）。在本研究中，使用的生长调节剂浓度及其培养基的比例是有效的。评估不同沃氏培养基浓度（0%至100%）非常重要，因为不同品种和生根阶段的营养需求可能显著不同。例如，‘Bluegem’在75%沃氏培养基浓度下 rooting效果最佳，这表明其在IBA诱导后偏好较低的养分浓度，可以防止愈伤组织形成并促进根系的健康发育。

活性炭也是体外根系发育和随后体外存活的关键因素，因为它能促进根系生长，减少培养基中的抑制物质，并释放有助于培养物生长的天然物质（Meneguzzi等人，2020年）。然而，本研究并未发现所有品种在使用活化炭处理与否的情况下根系生长表现存在差异，这与先前的研究结果不同。Tejada-Alvarado等人（2022年）在Bluecrop和Biloxi品种的研究中发现了不同的结果：当培养基中含有活性炭时，根际发育能力得到了改善。在另一项涉及Vaccinium corymbosum L.的研究中，El-Dis等人（2018年）观察到，在培养基中添加活性炭可以提高植物的体外生根率，从而促进幼苗更好地适应新环境。关键的是，我们的研究发现活性炭仅对‘Climax’品种有益，该品种的生根情况得到增强，体外存活率也更高（表11）。这一结果与先前的文献（Tejada-Alvarado等人2022年；El-Dis等人2018年）存在明显差异，这凸显了微繁殖反应的显著品种特异性。这种差异可能归因于不同蓝莓品种在酚类化合物分泌或对特定培养基成分的敏感性方面的遗传差异，这些因素会影响活性炭吸附特性的有效性。这表明，尽管活性炭通常被认为具有益处，但其应用仍需要针对具体品种进行验证。

此外，本研究还表明，优质根系的发育会影响幼苗的适应期。如前所述，体外存活率是衡量体外生根过程成功与否的重要指标。所分析的三个品种都表现出较高的体外存活率，这支持了所开发技术的有效性。

综上所述，2-ip与硫酸腺嘌呤的组合使用为作物的微繁殖过程提供了有趣的结果。这可能是因为外植体能够在不受到水分供应和遗传特性负面影响的情况下继续产生光合色素。

在生根过程中，不同蓝莓品种对AIB引起的生根刺激的反应各不相同，无论是否有活性炭存在，这表明制定统一的体外生根阶段协议存在困难。

结论：硫酸腺嘌呤与2-ip浓度的相互作用导致所有分析的蓝莓品种的芽数增加，植株更加均匀，尽管最佳浓度因品种而异，但这些条件优化有助于后续微繁殖阶段的进展。微插条初次接种IBA以及不同浓度的WPM培养基（无论是否含有活性炭）直接影响了三种分析蓝莓品种的生根过程。因此，优化这些条件是提高品种在适应期表现的最佳途径。