基于聚多巴胺修饰金纳米枝晶/氧化石墨烯电极的细菌印迹聚合物传感策略用于高灵敏度、高选择性检测大肠杆菌

《Analyst》：Bacterial imprinted polymer-based detection of Escherichia coli using polydopamine on gold nanodendrite/graphene oxide modified electrodes

为应对食源性与水源性致病菌对公共卫生、环境安全及食品质量的重大威胁，开发快速、灵敏、经济的检测方法迫在眉睫。本研究报道了一种基于氧化石墨烯(GO)、金纳米枝晶(AuNDs)和聚多巴胺(PDA)修饰玻碳电极的细菌印迹电化学传感器，用于选择性识别大肠杆菌。该传感器结合了AuNDs/GO的高导电性与印迹PDA层的分子识别能力，展现出了优异的检测性能，在真实水样检测中也表现出高回收率，为环境监测提供了便携、可靠的检测平台。

　　

在当今全球公共卫生、环境与食品安全领域，致病菌的污染是一个巨大且持续的挑战。每年，不安全食品导致全球约6亿人患病，其中水源性病原体是主要元凶。在众多致病菌中，大肠杆菌(E. coli)是引发水源性和食源性疾病的关键病原体之一。然而，传统的细菌检测方法，如基于培养的技术和免疫分析，通常耗时耗力，需要培养可见菌落来放大信号。虽然诸如聚合酶链式反应(PCR)等DNA技术已发展起来，但它们仍受限于检测时间、高成本以及对低丰度样本富集的要求。为了有效监控水质、预防疾病传播，迫切需要一种成本低廉、快速灵敏的病原体检测新方案。

为此，一篇发表在《Analyst》上的研究论文，报道了一种创新的电化学生物传感器。研究人员将目光投向了分子印迹聚合物(MIPs)，这是一种可模拟目标分子（如细菌）尺寸、形状和功能基团的合成聚合物，以其高稳定性、低成本和对苛刻环境的耐受性著称，可作为生物识别层。本研究成功设计并制备了一种用于选择性识别大肠杆菌的分子印迹电化学传感器。该传感器的核心在于，在玻碳电极(GCE)上通过层层组装，依次修饰了氧化石墨烯(GO)和金纳米枝晶(AuNDs)，随后通过多巴胺(DA)的电化学聚合形成聚多巴胺(PDA)印迹层。其中，AuNDs的引入显著增强了传感器的导电性和灵敏度，而PDA凭借其优异的生物相容性、自聚合特性及丰富的官能团，被选为分子印迹的有效功能单体。研究通过密度泛函理论计算证实，相较于其他导电聚合物，PDA与大肠杆菌细胞外膜上的脂多糖具有最有利的结合能，从而可形成更特异、互补的识别位点。

为了开展研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：1. 传感器制备与修饰：通过顺序滴涂GO溶液、沉积AuNDs，再在含大肠杆菌模板的溶液中电聚合DA，构建细菌印迹聚合物层，并通过酸/表面活性剂溶液洗脱模板，形成印迹空腔。2. 表面与成分表征：利用扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)直观表征电极表面在每一步修饰后的形貌变化，确认了细菌印迹空腔的形成；通过X射线光电子能谱(XPS)分析各步修饰后的元素组成和化学态。3. 电化学性能评估：综合运用循环伏安法(CV)、微分脉冲伏安法(DPV)和电化学阻抗谱(EIS)等电化学技术，系统评估电极的导电性变化、界面电荷转移电阻(R_ct)以及对细菌的检测灵敏度。4. 选择性测试：利用表达mCherry荧光蛋白的大肠杆菌AR3110作为印迹模板，并测试传感器对包括大肠杆菌DH5α、假单胞菌(P. defensor)、芽孢杆菌(B. velezensis)在内的不同细菌的响应，以评估其选择性。5. 实际样品验证：从当地河流和处理厂获取真实水样（溪水和废水），通过标准加入法评估传感器在复杂基质中的实际检测能力和回收率。

研究结果部分通过多个维度的实验，验证了传感器的有效性：

3.1. 表面形貌与成分表征：SEM图像清晰地展示了GO的多孔片层结构、GO/AuNDs表面的枝晶状结构，以及PDA膜在洗脱细菌前后形貌的显著对比，证实了细菌模板的成功移除，并在膜表面形成了相应的空腔。AFM图像进一步提供了纳米级的形貌细节，测量了被捕获细菌的长度、高度以及洗脱后印迹空腔的深度，确认了PDA膜厚度的精确控制和印迹位点的成功创建。XPS分析则从元素化学态层面验证了GO、AuNDs和PDA的成功修饰。

3.2. 电化学表征：CV和DPV的氧化还原峰强度变化，以及EIS测得的电荷转移电阻(R_ct)数值变化，共同揭示了电极修饰过程对电子传递能力的影响。结果显示，GO和AuNDs的修饰显著降低了R_ct，提升了导电性；而PDA聚合和细菌嵌入会因材料的绝缘性大幅增加R_ct；洗脱细菌模板、暴露印迹空腔后，R_ct值大幅下降，这有力地证明了细菌的成功移除和印迹识别位点的暴露。

3.3. MIP优化与校准研究：该部分是研究的关键，旨在优化传感器性能。首先，研究人员比较了不同的细菌模板洗脱方法。与传统的乙酸/十二烷基硫酸钠(CH₃COOH/SDS)溶液相比，使用硝酸/十二烷基硫酸钠(HNO₃/SDS)溶液结合超声处理，能更高效、快速地移除细菌，获得更低的R_ct值，从而确定20分钟的超声处理为最优洗脱条件。其次，通过控制电聚合循环次数（10, 15, 20圈）研究了PDA膜厚度对传感器性能的影响。结果表明，10个聚合循环形成的较薄MIP层表现出最宽的线性检测范围（1.0 × 10¹–1.0 × 10⁴CFU mL^?1），而更厚的膜（15和20圈）会限制检测上限。基于最优条件构建的传感器，其R_ct变化值(ΔR_ct)与大肠杆菌浓度（对数坐标）在1.0 × 10¹至 1.0 × 10⁴CFU mL^?1范围内呈良好线性关系，检测限(LOD)低至1.5 CFU mL^?1。通过Langmuir–Freundlich等温线拟合得到的高亲和常数(K_a)也证实了MIP对目标细菌具有很强的结合能力。

3.4. MIP基传感器的选择性：选择性测试结果显示，当传感器暴露于不同种类的细菌时，其对作为印迹模板的大肠杆菌AR3110菌株表现出最显著的R_ct增加，而对非目标菌株如假单胞菌(P. defensor)和芽孢杆菌(B. velezensis)仅引起微小的响应。对同属大肠杆菌但不同菌株的DH5α，传感器的响应虽然高于非目标菌，但仍显著低于AR3110模板菌。这种高选择性归因于MIP空腔与目标细菌在尺寸、形状和表面化学特征上的精确互补匹配，以及大肠杆菌AR3110产生的卷曲菌毛(curli)可能增强了其与PDA基底的粘附。

3.5. 实际样品研究：为评估传感器在实际环境监测中的适用性，研究将其用于检测经PBS稀释后的真实溪水和废水样本。通过标准加入法，计算出传感器对两种水样中大肠杆菌的回收率分别在96%至103%之间，证明了其在复杂基质中检测的准确性和可靠性，具备了实际应用的潜力。

3.6. 从GCE到SPE：迈向便携性的一步：为适应现场环境应用，研究还将同样的修饰策略应用于丝网印刷电极(SPE)上，开发了便携式传感器版本。SPE基传感器虽然线性范围（1.0 × 10¹–1.0 × 10³CFU mL^?1）略窄于GCE版本，但获得了更低的检测限(1.3 CFU mL^?1)。GCE具有化学均一、无粘合剂的表面，支持更均匀的MIP生长和更干净的模板去除，因此性能更优。然而，SPE的成本效益、可抛弃性和易于集成到便携设备中的特性，使其在现场快速检测方面具有独特优势。此外，研究还展示了制备的GCE传感器在室温下储存45天后性能无明显下降，证明了其良好的长期稳定性。

结论与讨论：本研究成功开发了一种基于GO/AuNDs/PDA修饰电极的高选择性、高灵敏电化学传感器，用于快速检测大肠杆菌。与文献报道的其他电化学检测方法（如基于抗体、适配体或金纳米颗粒的方法）相比，本工作所开发的MIP基传感器在检测限和检测范围上具有竞争力，甚至更优。更重要的是，与依赖于不稳定、高成本生物分子的传统生物传感器不同，全聚合物MIP传感器提供了更具成本效益和耐用性的替代方案。该传感器成功在真实水样中检测出大肠杆菌，并展现出优异的选择性和稳定性，为其未来在环境监测、食品安全等领域的便携式、现场检测应用铺平了道路。这项研究不仅证明了细菌印迹聚合物结合纳米材料增强电化学传感的有效性，也为开发稳定、经济的下一代病原体快速检测平台提供了有价值的思路。