综述：探索微流控纸质分析设备在唾液诊断中的作用：从概念到临床应用

《Analyst》：Exploring the role of microfluidic paper-based analytical devices in salivary diagnostics: from concept to clinical applications

　　微流控纸质分析设备（μPADs）在过去几十年中取得了显著发展，从简单的比色条发展到多功能芯片实验室系统。本综述重点关注μPADs的发展进展，特别是其在唾液诊断中的应用。它涵盖了这些设备的基本方面，包括制造方法、检测策略（重点是比色法和电化学法）、正在研究的关键生物标志物以及当前面临的挑战。唾液作为一种有前景的诊断液体，因其非侵入性采集方式、低风险以及包含蛋白质、酶、激素和核酸等多种生化成分而受到重视。基于μPADs的唾液诊断方法符合世界卫生组织（WHO）的ASSURED标准，使其在初级保健和资源有限的环境中具有巨大潜力。虽然一些唾液生物标志物已在临床上得到验证，但许多标志物仍需进一步研究，并需要与传统的诊断方法进行更准确的比较。我们的综述还强调了科学界如何解决剩余的挑战，如生物标志物的变异性、样品预处理步骤的整合以及生物成分的干扰问题。通过这些努力，我们展示了将μPADs发展为全球公共卫生中可获取且有效工具的最新进展。

1. 引言

在脊索动物进化过程中，唾液腺从鱼类中不存在，到两栖动物中初步形成，再到爬行动物中发展得更为完善，最终在哺乳动物中达到顶峰。1–3 这些腺体可能起源于颊上皮组织，最初在分层上皮组织中出现分泌颗粒。在哺乳动物中，唾液的成分会随饮食变化，主要作用是润滑食物以便咀嚼、捕捉昆虫和促进吞咽，这一点从普遍存在的黏液产生细胞中可以得到证明。唾液在消化过程中也起着关键作用——主要是通过酶如淀粉酶——并有助于口腔健康。其次，唾液还参与离子运输、分泌药理活性化合物、重新吸收血液中的蛋白质以及稀释食物。人类拥有三对主要的唾液腺——腮腺、下颌下腺和舌下腺——以及分布在口腔和上呼吸道黏膜中的众多小腺体。4,5

人类每天会产生1200至1500毫升的唾液。2 唾液的分泌是由副交感神经刺激介导的；乙酰胆碱是活性神经递质，它与腺体中的毒蕈碱受体结合，从而增加唾液分泌。6 在口腔内，所有唾液腺产生的唾液会混合，并与其他可能由受损组织或不同部位（尤其是牙周组织）产生的分泌物结合。这种复杂混合物的成分可能与多种健康状况有关，因此对其仔细分析不仅可以提供关于口腔健康的线索，还可以为全身健康状况提供重要信息，成为其他体液分析的补充。4,6–9

1.1 唾液作为诊断液体

历史上，唾液在多种文化和文明中都被用作诊断工具，包括古希腊和罗马、传统中医以及阿育吠陀医学，当时它被视为反映“身体失衡”或“生命能量”的重要指标。现代医学主要依赖血液、尿液和其他体液的分析，但最近人们重新关注唾液作为补充诊断工具的价值。2,5,10

唾液的诊断潜力在于其非侵入性的采集方式以及能够全面反映身体的生理状态。与需要针刺的血液不同，唾液可以轻松采集且不会引起不适，使其成为频繁监测的理想选择。此外，唾液中含有反映局部口腔和全身健康状况的生物标志物，如激素、抗体、核酸和各种代谢物。11,12

唾液诊断能力扩展到感染性疾病、自身免疫性疾病甚至癌症的检测。例如，唾液中特定病毒RNA的存在可以指示COVID-19等感染，而某些蛋白质水平的升高可能表明患有Sj?gren综合征等自身免疫性疾病。13 唾液诊断还可以在监测代谢紊乱方面发挥关键作用，因为唾液成分的变化可以反映身体代谢过程的变化。14,15

唾液分析可以提供关于个体激素水平、压力标志物和药物使用的信息，使其成为健康监测的多功能介质。其通过检测特定生物标志物揭示全身状况的潜力凸显了其作为诊断工具的价值，补充了传统方法，提供了更全面的个体健康状况图谱。16

尽管唾液诊断具有巨大潜力，但仍需解决一些挑战以提高其有效性：主要问题包括潜在分析物的浓度极低、分泌量受食物或其他刺激的影响，以及需要标准化采集和保存方法。

1.2 微流控纸质分析设备（μPADs）

微流控纸质分析设备（μPADs）是诊断技术和即时检测（POC）领域的重大进步。这些设备使用纸张作为基底，创建微流控通道，从而能够处理和分析少量液体，如唾液、血液或尿液。μPADs具有许多优势，包括低成本、简单性、便携性以及快速准确的诊断结果潜力。17,18

μPADs的概念源于对资源有限环境中可负担得起且易于使用的诊断工具的需求。μPADs的发展受到了微流控原理的影响，微流控技术涉及在微观尺度上精确控制和操纵液体。早期的纸质设备原型展示了使用纸张创建流体路径的可行性，从而确立了PADs作为微流控领域中的一种独特技术。19–21

μPADs的设计涉及在纸张上创建通道和区域，使液体能够流动并与浸渍在纤维素表面的特定化学物质发生反应。这些设计可以通过多种方法实现，如蜡印、22 喷墨打印、23 切割、24,25 和光刻。26 每种方法都有其优缺点，但蜡印因其简单性和成本效益而特别受欢迎。用于开发μPADs的纸张基底通常经过处理以增强其流体处理性能并支持试剂的附着。通常使用疏水屏障来定义液体流动的通道，而亲水区域则促进液体传输和反应。纸张的选择、屏障材料和制造技术都影响着μPADs的功能性和性能。27,28

总体而言，μPADs在诊断领域展示了巨大潜力，为快速、准确且经济高效地检测各种健康状况提供了平台。它们的应用范围广泛，不仅限于传染病检测，例如可以用于检测体液中的细菌、病毒和真菌。29,30 例如，在COVID-19大流行期间，开发了μPADs来检测唾液中的病毒RNA，提供了一种非侵入性和快速的诊断工具，可以在传统实验室环境之外使用。31

其他应用可能包括通过监测葡萄糖、酮体和其他代谢物来诊断代谢紊乱（如糖尿病），以及通过测量微量特定蛋白质、核酸或抗体来检测与自身免疫或癌症疾病相关的生物标志物。16,18,32

POC技术通过在现场提供即时结果，彻底改变了诊断方式。这些技术为疾病检测、监测和管理提供了便捷、快速且经济高效的方法。4,32 POC诊断适用于医院、诊所甚至偏远地区，使医疗保健更加便捷和高效。像μPADs这样的创新诊断工具的发展进一步增强了POC技术的能力。10

μPADs最重要的优势之一是它们适用于POC技术，允许在患者护理现场立即进行测试并获得结果，无需依赖集中式实验室和漫长的等待时间。μPADs可以集成到POC系统中，提供快速诊断结果，这对于及时医疗决策和治疗至关重要。33

基于纸张的设备代表了诊断技术的一项变革性进步，提供了一种低成本、便携且高效的多种健康状况检测手段。它们在革新POC诊断和提供广泛适用的健康解决方案方面的潜力凸显了其在未来医学科学中的重要性。34 随着研究和技术的不断发展，μPADs有望成为全球医疗保健的重要组成部分，实现快速准确的诊断，挽救生命并改善全球健康状况。未来的研究和开发应集中在解决现有限制和扩展μPADs的功能上。材料科学、微流控设计和数据整合的创新将推动基于纸张的平台的进步，使其在更多诊断应用中更加稳健和多功能。33

基于这一背景，本综述提供了关于唾液作为诊断液体的最新和全面概述，重点介绍了其在基于纸张的微流控设备中的集成。考虑到唾液的进化、生理和生化意义，本文探讨了其复杂成分如何反映局部和全身健康状况。通过分析μPAD技术的当前进展及其与POC诊断方法的协同作用，我们旨在突出这些创新工具在促进可获取、非侵入性和经济高效的健康监测方面的潜力。特别关注了μPAD制造和检测方法的最新进展及其与唾液诊断的结合。尽管唾液的诊断相关性已得到充分证实，但其常规临床应用仍主要依赖于集中式实验室技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱（LC–MS/MS）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析。2,9,16 虽然这些方法提供了高分析灵敏度和特异性，但它们需要复杂的仪器、受过培训的人员、受控的实验室环境以及多步骤的样本准备，这往往伴随着较高的成本和周转时间。因此，唾液作为诊断液体的非侵入性与其在即时检测环境中的实际应用之间存在脱节。同时，在基于纸张的唾液诊断平台开发方面也取得了显著进展。然而，该领域仍然存在多样性，包括不同的制造策略、检测方法和临床验证水平，目前尚不清楚现有努力如何朝着稳健和可扩展的解决方案方向发展。本综述通过提供唾液诊断与微流控纸质分析设备（μPADs）整合的关键总结，探讨了技术进步、分析性能、验证状态和转化前景。

2. 纸张作为基底

由于其独特的性质，如生物相容性、易于制造、可调孔隙率、环保性和全球可负担性，纸张已被用于生物技术和生物化学中的多种用途。最终，这些独特性质，特别是其吸收和毛细传输能力，开始被系统地探索，尤其是在健康相关应用中。28,35,36

2007年，George M. Whitesides团队发表了一份关于将纸张作为分析设备使用的创新报告，首次展示了μPAD的实例。37 在这篇杰出的报告中，作者使用标准光刻技术创建了由疏水屏障限定的微通道，实现了无需泵或机械系统的自发流体传输。这项开创性工作确立了μPADs和PADs作为POC临床诊断的创新平台，最初专注于血液样本分析。此后，μPADs发展成为能够通过毛细作用操纵少量液体的巧妙系统，消除了对泵或外部电源的需求。这些设备能够实现局部化学反应和样品及试剂的高效传输，从而可以与传统的生物分析技术（如提取/分离过程、纯化方法和各种检测策略）集成。38 尽管比色法仍然是与这些设备结合使用的最常用检测技术，但电化学协议、荧光应用甚至纸喷雾电离结合质谱技术也扩展了应用范围和分析灵敏度。18

最初用于检测血液中的生物标志物，39 μPADs很快显示出对其他生物基质的潜力。特别是唾液因其非侵入性采集方式及其包含的相关诊断信息而成为有前景的样本。Blicharz和Nagler等人是最早使用纸张条进行唾液比色测试的先驱，重点关注硝酸盐和尿酸等生物标志物，特别是在临床环境中，包括终末期肾病患者。9,40 这些研究证明了简单且经济的设备可用于非侵入性监测唾液中的生物标志物。他们的报告虽然不是在μPADs的背景下提出的，但为后续研究中用于唾液分析的PADs的发展树立了一个里程碑。从那时起，多项研究扩展了使用μPADs进行唾液分析的范围，使得感染性疾病、代谢性疾病甚至神经性疾病的监测变得实用且易于实现。41 除了人类健康领域，μPADs还因简单性、低成本和便携性而在环境监测、42 石油化学、43 法医学、44 和食品质量控制45 等其他领域得到了广泛探索。

2.1 基于纸张的唾液诊断设备的制造考虑

自从开创性的报告展示了使用光刻技术在纸上创建微流控通道以来，μPADs的制造技术已经取得了进展。如今，引入了蜡印、37 激光烧蚀、20 喷墨打印、27 和丝网印刷46 等新方法，使得设计更加多样化、易于获取且可扩展。这些方法的发展旨在改善流体控制、提高分析性能并促进与检测系统的集成。37 鉴于这些固有的优势，基于纸张的平台在即时诊断（POC）中变得特别有吸引力，尤其是在基于唾液的应用中。如图1所示，建立唾液分析和诊断协议的过程包括几个关键步骤，包括选择目标分析物、检测方法以及最适合达到最佳分辨率的纸张类型。唾液是一种特别适合μPAD应用的生物流体，这得益于其物理化学性质，特别是其粘度，根据水合和刺激条件的不同，粘度大约在1.0到3.0 mPa s之间。这与水的粘度（在25°C时约为0.89 mPa s）相近，允许在多孔基底中实现可预测且均匀的毛细流动。46 因此，唾液几乎可以与所有现有的μPAD制造技术兼容，包括高分辨率和低分辨率的图案化方法。因此，基于唾液的诊断的制造策略的选择往往不是由流体兼容性决定的，而是由其他实际考虑因素决定的，如生产成本、设备可用性以及是否适合在偏远或资源有限的环境中使用。图1

图1展示了唾液产生途径——这种重要的流体反映了患者的健康和临床状况——它来源于唾液腺，以及如何为这种基底设计使用PADs的分析协议。该协议可能因目标分析物的不同而有所差异：首先根据分析物的化学性质选择最合适的检测方法，然后选择支持检测技术并作为唾液处理的储存器的纸张类型，最后根据用户便利性定制制造方法。尽管制造方法多种多样，但批次间的变异性仍然是一个不可忽视的问题。纸张的孔隙率、纤维分布、表面处理和手动试剂沉积的差异可能导致毛细流速和分析结果的波动。当需要定量读数时，这种变异性变得尤为关键，这突显了标准化制造工作流程和质量控制协议的必要性。为了解决这些问题，选择合适的基底类型对于构建有效的唾液传感器至关重要，应在考虑检测技术和涉及的分析步骤的要求时作为首要考虑因素。

2.1.1 纸张选择

纸张类型在基于纸张的设备的制造中起着重要作用，必须在制造步骤之前根据设备的预期应用来确定。47–49 在诊断应用中，设备中将使用的分析技术类型是决定制造方法和纸张基底选择的主要因素，因为这些将决定设备的流体行为、灵敏度和整体分析性能。用于制造μPADs的纸张有多种类型，每种都有特定的性质，直接影响诊断测试的性能。最常用的用于制造基于纸张的分析设备的纸张包括色谱纸、50–52 办公纸、53,54 定性滤纸、41 植物纸、55 吸收纸和硝化纤维素膜。56,57 图2展示了文献中不同μPAD格式的关键示例，这些格式都是基于各种纸张类型开发的，都应用于唾液分析。色谱纸和滤纸是最早用于唾液分析的纸张基底。色谱纸——特别是Whatman? Grade 1——因其均匀的孔隙率、良好的试剂保留能力和一致的毛细流动而广泛使用。色谱纸为分离提供了出色的分辨率，非常适合涉及多个反应区的检测。58 办公纸作为一种廉价且广泛可获得的替代品也被探索，特别是在不需要高精度液体流动的应用中。吸收纸由于其高液体吸收能力和能够容纳大量样本的能力，常用于侧向流动检测。54 另一方面，硝化纤维素膜在免疫检测中特别受到重视，因为它们具有强蛋白质结合能力和快速的毛细作用。正确选择纸张类型对于确保基于纸张的仪器的灵敏度、选择性和重现性非常重要，特别是在临床诊断应用中。19,59,60

图2

展示了使用色谱纸（A）、硝化纤维素（B）、吸收纸（C）、定性滤纸（D）、办公纸（E）以及色谱纸（上层）和羊皮纸（下层）（F）组合构建用于唾液样本临床分析的传感器的不同基于纸张的分析设备的示意图。图像A、B、C、D、E和F分别经Bhakta等人，61 Kim和Kim，66 Ramdzan等人，191 Noiphung等人，100 Gutiérrez-Gálvez等人，69 和Sousa等人，55的许可重新打印。尽管纸张选择通常由分析兼容性指导，但关于功能化基底批次间重现性和长期存储稳定性的报道仍然有限，这在文献中仍是一个空白。在临床环境中，即使是微小的吸水速度或蛋白质结合能力的差异也可能影响定量准确性和设备间的可比性。在唾液诊断的背景下，选择具有高吸收能力和可控孔隙率的纸张是为了确保样本的有效传输和与试剂的相互作用。Bhaktha等人进行了使用μPADs进行唾液诊断的开创性工作，他们开发了一种用于检测唾液中亚硝酸盐的比色装置，如图2A所示。在他们的研究中，作者选择了Whatman Grade 1色谱纸，因为它具有良好的吸水特性和与基于改良Griess反应的比色检测方法的兼容性。这些装置被设计用于量化亚硝酸盐水平，这是牙周炎的潜在标志物，并展示了适合实际样本分析的灵敏度和检测限（LOD）。61

然而，对于需要特定生物分子相互作用的应用示例，如免疫检测，通常更倾向于使用硝化纤维素膜。虽然硝化纤维素由于其三维纤维网络和高吸附能力（特别是对蛋白质和核酸）而比色谱纸更具孔隙性，但由于其较小的孔径和更密集的结构，其对毛细流动的渗透性较低。62,63 这种渗透性的差异直接影响仪器设计和检测性能，特别是在控制流速和最大化反应时间至关重要的情况下。64

这种效应通常决定了在免疫检测中使用硝化纤维素而不是色谱纸。例如，Choi等人开发了一种使用光致发光薄膜的侧向流动免疫检测（LFA）来检测唾液中的皮质醇。65 该检测通过基于智能手机的光致发光检测和机器学习算法进行数据分析，能够在不需要外部光源的情况下准确测量人类唾液样本中的皮质醇。同样，Kim和Kim提出了一种自动信号增强的侧向流动免疫检测（asLFI），如图2B所示，显著提高了唾液中皮质醇检测的比色灵敏度，检测限（LOD）达到3.8 pg mL?1，并与ELISA结果有很强的相关性。66 因此，硝化纤维素仍然是LFA的标准材料，并且由于其高蛋白质结合能力，仍然广泛用于基于唾液的诊断中，这使其能够可靠地固定抗体和抗原。这些性质在免疫诊断中至关重要，因为特定的抗原-抗体相互作用必须在没有分散的情况下发生在受限区域内。67

定性滤纸由于其高孔隙率，可以分离唾液中的固体，而吸收纸则有助于液体的收集和分布，这对于在微流控设备中控制样本的移动至关重要。尽管不如色谱纸那样被广泛报道，但这些材料的价值在于它们能够显著降低设备的最终成本。图2C和D分别展示了使用吸收纸和定性滤纸进行唾液分析的示例。68

办公纸也被用作唾液分析的可行选项，因为其性质与色谱纸相似，但亲水性较低，允许物质更容易在其表面积累。Gutiérrez-Gálvez等人通过将基于办公纸的收集器集成到N95口罩中，用于检测呼出气体中的SARS-CoV-2刺突蛋白，如图2E所示。69 该方法使用基于磁珠的电化学免疫传感器，展示了高灵敏度和选择性，能够在不需要化学试剂的情况下准确检测生物标志物。这项研究突显了纸张作为收集材料的潜力，展示了其在快速和易于获取的呼吸系统疾病诊断工具中的应用。Sousa等人描述了一种结合不同类型纸张优势的替代方法，他们开发了一种手动制造协议，用于在色谱纸上实现更高分辨率的比色模块。55 这与使用丝网印刷技术在羊皮纸上定义导电路径相结合。图2F展示了最终设备，其中两个模块使用光固化树脂进行了集成。

2.1.2 表面处理

表面处理通常用于优化纸张以适应特定应用。最近的研究探索了纸张表面的化学和结构修改，以提高分析性能。壳聚糖特别适合用于μPADs的纸张修改，因为它具有生物相容性、成膜能力以及增强表面功能性和分析物相互作用的氨基团。70 例如，Castro等人通过用壳聚糖修改表面来提高唾液样本中葡萄糖和亚硝酸盐检测的均匀性，从而提高了比色测量的灵敏度和可靠性。71 同样，Chi等人设计了一种可生物降解的流体设备，能够高效采集唾液并检测唾液生物标志物。他们的设备使用了壳聚糖海绵来采集唾液，并使用酶包封的水凝胶来增强葡萄糖和肌酐等生物标志物的比色检测，展示了其在POC诊断中的潜力。72

纳米颗粒的功能化，特别是使用金或银纳米颗粒，已被证明可以增强比色检测，提高电化学和比色检测的灵敏度，甚至实现无酶检测。73,74 金纳米颗粒（AuNPs）被用作类似过氧化物酶的纳米酶，以促进基于纸张的设备的葡萄糖监测，提供快速可靠的比色读数。74

尽管仍然较新，但使用过氧化钠的氧化处理也被报道可以在纤维素表面引入醛基团，从而允许随后共价偶联抗体和其他生物识别元素，以提高检测的稳定性和选择性。此外，等离子体处理是一种多功能方法，用于增加表面能并提高润湿性，通常作为预处理步骤以促进进一步的功能化。75 这些表面策略在基于唾液的诊断中特别有价值，因为在低分析物浓度和基质干扰的情况下需要提高选择性、强分析物保留能力和可控的微流控行为，以确保准确和可重复的结果。然而，许多表面修饰策略，特别是那些涉及纳米颗粒或酶固定的策略，在非受控存储条件下可能会影响长期稳定性。湿度、氧化和生物活性的逐渐丧失会显著缩短保质期，这在大多数概念验证研究中尚未得到充分解决。因此，未来的发展应优先考虑稳定策略，如保护涂层、添加稳定剂、优化包装和系统的保质期验证，以确保表面修饰的μPADs的实际适用性和现实世界的稳健性。

2.1.3 制造策略

基于纸张的分析平台的制造已经取得了显著进展，从更复杂的方法发展到更简单、更具成本效益的技术，这些技术促进了这些设备的大规模生产和在POC环境中的应用。Whitesides团队的开创性研究使用了光刻技术和色谱纸，但最初的制造技术选择已经转向了更易于获取和高效的方法，越来越关注新工具和替代纸张基底，37 每种方法根据预期应用提供独特的优势。打印方法

打印技术是制造基于纸张的设备的最常用方法之一，因为它们具有多功能性、低成本和可扩展性。已经探索了几种不同的打印方法来生产μPADs（微流控纸基分析设备），每种方法都有其自身的优缺点。蜡印是一种最著名的方法；在这种方法中，蜡被沉积在纸张基底上，然后可以熔化以创建疏水屏障，如图3A.22,76所示。多年来，这种技术已被证明能够创建稳定的疏水屏障，并且非常经济实惠，适用于高通量应用。这种制造方法的主要问题是激光打印机已经不再使用，因为它们已经被停产了。

用于唾液分析的微流控纸基分析设备（μPADs）的制造技术的代表性示例。(A) 蜡印：通过将蜡沉积并熔化在纸张基底上来形成疏水屏障。(B-i) 使用手工工具切割纸张以定义微流控区域；(B-ii) 使用激光切割和雕刻来精确地微结构化纸张，以增强流体控制并创建复杂的通道。(C) 结合手工绘图和3D笔来定义疏水区域，并使用碳基墨水进行丝网印刷，以形成用于双模式检测的导电电极。(D-i) 使用紫外线光和光刻胶涂层的纸张进行光刻制造，以生成高分辨率的微流控图案；(D-ii) 使用蜡浸渍技术，通过激光切割的模具将熔化的蜡转移到纸张上，以快速形成疏水屏障。图片A、B、C和D经许可转载自Rossini等人，188；de Castro等人，71；Pomili等人，85；Klasner等人，92；Songjaroen等人，76；以及Sousa等人，55。因此，其他与打印相关的制造方法也变得越来越流行，并且可以通过唾液分析来探索。激光打印可以对材料沉积进行精确控制，允许直接修改纸张以创建高效的疏水屏障。

喷墨打印使用商业或定制配方的墨水在纸张上创建图案，它具有多功能性并且广泛可用。除了定义疏水屏障外，喷墨技术还能够将含有酶、抗体、纳米颗粒或氧化还原介质的生物墨水精确地沉积在特定的检测区域。这种数字且无需掩模的方法允许控制试剂加载量，减少材料消耗，并提高空间分辨率。最近在可打印生物墨水配方方面的进步增强了生物分子的稳定性，并最小化了喷嘴堵塞，从而提高了μPAD制造的可重复性和可扩展性。

例如，Liang等人展示了一种使用改良的商业喷墨打印机进行AST（丙氨酸氨基转移酶）和ALT（天冬氨酸转氨酶）检测的低成本试剂喷涂方法，突出了其可扩展性和可重复性。基于喷墨的生物打印技术的进步加深了对生物墨水配方、液滴动力学、剪切诱导应力以及基底-液滴相互作用的理解。优化细胞或生物分子的均匀性和液滴撞击行为对于确保均匀沉积和功能稳定性起着关键作用。尽管这些技术主要是为组织工程开发的，但这些见解可以直接应用于μPAD制造，其中试剂分布的均匀性和沉积精度强烈影响分析的可重复性和设备性能。

3D绘图打印机虽然仍处于起步阶段，但可以在纸张基底上打印功能性材料或结构元素，以创建更复杂的三维设备。Espinosa等人通过将3D打印与蜡丝结合，展示了在纸张基底上制造疏水通道的方法。

最新的打印策略之一是热转移打印，它利用热量将墨水从带状物转移到纸张基底上，常用于创建精确的图案和设计。Monju等人已经探索了这种技术在基于纸张的检测中创建疏水屏障的应用，并且最近在使用这种技术方面取得了进步，提高了图案的保真度和设备性能。每种打印方法都提供了独特的优势，使它们在PAD（纸基分析设备）的制造中非常有价值，包括在唾液诊断中的应用。

切割和雕刻技术

切割技术对于将基于纸张的基底塑造成μPADs所需的形状至关重要，而无需任何材料的疏水屏障，从而消除了化学兼容性问题。无论是手工（图3B-i）还是基于激光（图3B-ii）的方法都提供了多种选项，用于定制切割协议中使用的设备形状。激光雕刻能够精确地微结构化纸张基底，特别适合于制造复杂的μPAD架构所需的复杂设计。Pungjunun等人展示了使用激光雕刻的空心微毛细通道来构建基于纸张的微流控设备，该设备能够进行双模式检测——比色和电化学检测——用于唾液生物标志物。他们的设备专门设计用于处理粘稠样本，如人类唾液，使用激光微图案化的毛细槽作为微泵，无需外部仪器即可增强流体传输。这种方法展示了基于激光的制造方法在唾液诊断开发中的潜力，提供了低成本、便携且样本效率高的替代方案，用于检测如硫氰酸盐等分析物，具有高灵敏度和可靠性。基于手工切割的图案化技术，例如使用Silhouette Studio平台进行的技术，仍然是开发基于纸张的微流控设备的相关且可行的方法，特别是在资源有限的环境中。这些手工图案化的设备包括通过微流控通道连接的独立检测区域，并已通过真实的人类唾液样本成功验证，结果显示与分光光度分析的结果相当。除了传统的雕刻技术外，激光烧蚀还能对纸张基底进行更精细的微结构控制。通过调整激光波长和功率，不仅可以定义通道几何形状，还可以局部调节纸张厚度、孔隙率和表面化学性质，从而影响毛细压力和流体传输。最近的研究表明，受控的激光处理可以在保持机械完整性的同时修改纤维素网络，直接影响吸液行为和传感性能。

手动策略

手动协议是使用简单方法（如冲压、丝网印刷和手绘）来制造基于纸张的设备的基本技术。这些方法所需的设备最少，特别适合低成本开发和早期应用。冲压涉及将带有图案的模具压在纸张基底上，以创建所需的形状或屏障。这种技术已在唾液诊断设备的早期开发阶段使用，其中简单的图案化对于基本功能已经足够。丝网印刷是一种成熟的制造μPADs的技术，它能够使用网状筛网将疏水材料精确地沉积在纸张基底上。这种方法特别适合大规模生产，因为它具有可重复性和低成本。Sitanurak等人展示了使用PVC基T恤墨水制造高分辨率（486 ± 14 μm）和优异化学抗性的疏水屏障，适用于唾液中分析物（如亚硝酸盐和硫氰酸盐）的比色检测。最近，Silva-Neto等人采用了使用玻璃清漆作为疏水剂的模板印刷方法来制造用于检测唾液α-淀粉酶的μPADs，实现了可靠的微流控性能，并在真实唾液样本中成功应用。

手绘是一种可访问且低成本的方法，用于制造基于纸张的微流控设备，其中疏水屏障和功能区域直接在纸张基底上使用笔或标记器创建。一个显著的例子是使用3D笔，正如Sousa等人所报告的，他们展示了通过手工绘制丙烯酸树脂图案并随后进行紫外线固化来创建μPADs的可行性。尽管这种方法简单，但它对于临床和环境应用都非常有效，包括唾液诊断。这种无仪器且经济的方法特别适合快速原型制作和在任何地方实施。图3C展示了结合手绘和丝网印刷协议的示例。通过结合手绘技术和丝网印刷方法，作者展示了一种多功能的“自己动手”（DIY）协议，用于制造双检测基于纸张的分析设备（双μPADs）。使用3D笔绘制疏水屏障，并使用碳基墨水的模板印刷方法来生产导电电极，作者成功开发了能够同时进行比色和电化学检测的μPADs。这种策略使得无需复杂仪器即可分析唾液生物标志物，如亚硝酸盐、乳酸、pH值和α-淀粉酶，增强了低成本制造方法在即时诊断中的潜力，特别是在牙周病筛查中。

光刻

光刻是一种高精度方法，传统上用于在其他类型的基底（如玻璃）上制造微设备。这项技术在基于纸张的微流控设备中也找到了应用，因为它可以使用紫外线（UV）光来曝光光刻胶涂层表面，从而创建高分辨率的图案，允许选择性地去除材料并创建微尺度通道。光刻的精度使其特别适合需要高度定义流动模式的应用，例如诊断应用。Klasner等人展示了使用光刻制造μPADs，设备在3分钟内制造完成，并立即可用于尿液酮体、葡萄糖和唾液亚硝酸盐的比色检测（见图3D-i）。这些设备为临床相关的生物检测提供了半定量结果，证明了光刻在快速和易于获取的诊断应用中的潜力。然而，这项技术的高成本、对熟练劳动力和洁净室的要求使其不适用于即时诊断。尽管基于光刻的设备模型应该被考虑用于其他类型制造方法的进步，但这项技术尚未用于μPADs和诊断，包括唾液检测。

还有几种技术也被用于制造μPADs，每种技术都为唾液诊断应用提供了独特的优势。柔版印刷是一种使用柔性印版将墨水转移到纸张上的印刷过程，适用于大规模生产基于纸张的设备。最近的研究探索了其在高产量生产诊断设备方面的潜力，提供了一种可扩展且高效的方法。

蜡浸渍是一种简单且成本效益高的技术，涉及将纸张基底浸入熔化的蜡中以创建疏水屏障。这种方法在μPADs的制造中变得流行，因为它具有经济性和易于实施的特点。Songjaroen等人引入了一种新的蜡浸渍方法，使用通过激光切割创建的铁模具将图案转移到纸张上（见图3D-ii）。该过程快速，只需1分钟即可完成，无需复杂的仪器或有机溶剂。通过这种方法创建的疏水屏障已被证明能够有效支持临床诊断应用，包括葡萄糖和蛋白质的检测。

3. 基于纸张的设备的唾液分析工作原理

基于纸张的分析设备，特别是μPADs，通常通过结合由疏水屏障分隔的亲水区域来工作，从而实现精确的流体处理。二维μPADs（2D-μPADs）的特点是在单个平面表面上排列的微流控结构，其中通道在毛细力作用下引导流体移动。这些设备依赖于毛细作用进行流体传输，主要由Lucas-Washburn方程控制（公式（1）：

（1）

其中L(t)是液体前沿随时间t移动的距离，γ是表面张力，D是纸张的有效孔径，theta是接触角，μ是流体的动态粘度。这个方程强调了多孔基底中粘度与流速之间的反比关系，这在处理生物流体时是一个重要的考虑因素。在唾液的情况下，由于其非牛顿性质和较高的粘度（由粘蛋白和其他天然存在于其组成中的大分子引起），可能会降低流体在纸张基质中的迁移速率和均匀性。这种行为需要仔细调整设计参数，如纸张厚度、孔径大小和通道几何形状。例如，较厚的纸张或纤维紧密排列的纸张会增加水力阻力，这可以用达西定律描述（公式（2）：

（2）

其中Q是体积流量，k是纸张的渗透性，A是横截面积，ΔP是压力差（在DAPs中通常可以忽略），μ是粘度，L是流动路径长度。即使在毛细条件下，较高的粘度（μ）也会显著降低流速。克服唾液粘度对纸张设备可能影响的一种方法是适当的样本处理。多项研究报道了使用滤纸进行唾液的自采样和样品预处理，利用了滤纸本身的过滤特性。然而，也有其他方法描述了使用替代过滤材料来最小化生物污染效应。

Noiphung等人提出了一种有效的方法来规避基于纸张的设备中唾液粘度的影响。在他们的研究中，作者证明了在样品施加后添加一个简单的缓冲液清洗步骤可以稳定pH值和亚硝酸盐比色分析的响应，无论流体的初始粘度如何。这种策略使得即使在粘度从1.54到5.10 mPa s的人工样品中，也能获得一致且可重复的校准曲线，使μPAD的性能接近标准方法，而无需复杂的处理或稀释。除了控制基质本身外，调整通道宽度也可以优化流动动力学。较宽的通道有助于粘性样品（如唾液）的流动，而较窄的通道则增强了低粘度流体的毛细作用。此外，通道的逐渐变细或扩展可以策略性地用于调节流动并改善试剂相互作用区域。除了固有的粘度差异外，与唾液收集相关的预分析变量，如刺激性与非刺激性唾液、昼夜变化、水分状态和近期食物摄入，也会显著改变样品的粘度和表面相互作用特性。这些变化直接影响Lucas–Washburn和Darcy模型中描述的参数，改变μPAD通道内的毛细流动距离和体积流量。因此，标准化唾液收集协议并纳入补偿基质变异性的设计策略对于确保基于唾液的μPAD的可重复性和可靠的临床性能至关重要。

3.1 三维纸质微流控设备

三维μPAD（3D-μPAD）的使用对于分析复杂样品（如唾液）特别有利。这些设备允许流体在垂直和水平方向上流动，使得可以在纸张的重叠层中集成不同的分析步骤。与二维设备相比，3D-μPAD允许更复杂的配置，允许流体在多层纸张之间向侧向和垂直方向流动。这种架构有利于创建多个检测区域，从而能够同时快速定量不同的分析物。尽管这些设备更常用于更复杂的生物基质（如血液），但如果需要在系统本身内加入额外的预处理或分离步骤，它们也可以成为唾液分析的可行替代方案。

3.2 使用阀门的流量控制

对于涉及μPAD中唾液分析的应用，广泛考虑使用被动和自动阀门来实现更可控的流体传输的多步骤分析。文献中报道了简单且可溶的阀门，包括基于糖类（如海藻糖）的阀门，这些糖类可以在特定溶剂中溶解而不干扰后续的化学反应。蜡和壳聚糖等材料也因其物理化学性质对溶剂、温度或pH敏感而被研究。Chen等人提出了一种创新方法，使用直接打印在纸张上的蜡阀门，这些阀门在加入有机溶剂（如乙醇）后才会手动打开，如图4A所示。一旦打开，这些阀门不会干扰后续的毛细流动，允许在基于距离的检测分析中逐点控制试剂的释放。该设备已被用于量化人类唾液中的盐/牛奶和葡萄糖，检测限比之前报道的低11倍。图4

(A) 带有集成阀门的μPAD示意图，用于基于距离的葡萄糖检测。(B) 电渗泵阀（EOPV）的示意图。爆炸视图显示了分层组装：(a) 带有电极和超疏水表面的PCB，连接到储液器和检测区域，以及形成疏水间隙的硅胶密封件。面板(b–f) 描述了阀门的关键操作阶段：(b) 由于拉普拉斯压力阀门处于关闭状态；(c) 初始电渗激活；(d) 在垫片之间形成液体桥；(e) “剂量模式”具有间歇性流动；以及(f) 通过稳定的液体桥和持续的电渗流动实现的“连续模式”。分别经Chen等人106和Rofman等人109许可转载。Jiang等人开发了一种基于润湿性调节的简单便携式μPAD制造技术，使用手动电晕发生器。该策略涉及用十八烷基三氯硅烷（OTS）修改纸张表面使其疏水，然后通过掩模选择性地暴露于电晕放电，以在所需区域局部恢复疏水性。这种方法允许开发“开阀”功能，通过电晕点控来控制设备中流体运动的开始。该系统的可行性已在实际唾液样本中检测亚硝酸盐的比色分析中得到证明。还提出了更先进的技术，例如结合疏水屏障的电渗阀门，能够在原始唾液样本上直接执行LAMP等协议，并通过PCB实现温度和流量控制，如图4B所示。Rofman等人还提出了一种可编程的机械阀门阵列，可以在同一设备中并行和多重控制多达16个通道，并已成功应用于人工唾液中葡萄糖的量化。

4. μPAD上的唾液诊断检测技术

在唾液分析领域，由于比色和电化学检测方法与μPAD的核心原则（如低成本、微型化和便携性）相契合，因此被广泛探索。这些技术允许视觉读数或只需要简单的仪器，使其非常适合即时护理应用。最近，结合这两种检测方法作为一种有前景的策略出现，以解决每种方法的个别局限性。本节重点介绍了专为唾液诊断定制的比色、电化学和混合检测系统的关键特性、应用和集成策略。

4.1 比色方法

比色检测是PAD中最广泛使用的检测技术之一，特别是在临床诊断中。这种偏好归因于其操作简单性、即时视觉反馈、快速分析响应、低成本和令人满意的试剂稳定性。该技术的原理是基于目标分析物与预先固定在设备检测区域中的试剂之间的相互作用产生有色产物。

比色测量已成功应用于检测多种唾液生物标志物。代谢标志物，如葡萄糖、胆固醇、乳酸、钙和镁，已有效使用该技术进行测量。电解质和酶类生物标志物，包括亚硝酸盐、α-淀粉酶、尿素酶、硫氰酸盐和尿酸也已被检测到。此外，唾液中激素和免疫学标志物（如皮质醇、白细胞介素和甲胎蛋白）的检测也展示了比色方法的多功能性。除了生物标志物检测外，比色法还用于识别特定疾病的目标，包括猴痘、SARS-CoV-2和甲型及乙型流感。它在法医应用中也显示出潜力，例如检测唾液中的乙醇和植物大麻素。

比色检测所基于的反应机制可以分为酶促和非酶促过程。如图5所示，酶促和非酶促检测策略都已在μPAD的唾液分析中应用。酶促反应特别受欢迎，因为它们具有高特异性，并且能够产生可与显色指示剂相互作用的检测产物或副产物。一个著名的应用是使用葡萄糖氧化酶（Gox）进行葡萄糖的比色检测，它催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸，产生过氧化氢（H2O2）作为副产物（见图5A和B）。在过氧化物酶存在下，H2O2与显色底物（如碘化钾）反应，形成一种作为葡萄糖浓度可见指示剂的有色化合物。比色检测背后的反应机制可以大致分为酶促和非酶促过程。

图5

文献中的示例展示了使用PAD的酶促（左列）和非酶促（右列）检测协议。面板(A)展示了酶促检测机制的一般示意图，重点介绍了基于葡萄糖氧化酶（GOx）的策略，如(B)所示。面板(C)展示了在流动注射分析（FIA）系统中应用类似的酶促原理来检测皮质醇。在非酶促方面，可以检测到广泛的目标分析物。面板(D)描绘了一种代表性的亚硝酸盐检测方法，这是唾液PAD中最成熟的无机检测方法之一，而面板(E)展示了一种用于检测硫氰酸盐的双重检测设备。分别经Scarsi等人118、G?lcez等人111、Pomili等人85、Chanu等人114和Pungjunun等人87许可转载。Pomili等人展示了使用氧化酶（如葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶和胆固醇氧化酶）生成过氧化氢（H2O2）作为副产物的方法，并与等离子体多分支金纳米粒子结合使用。这些纳米粒子在H2O2的作用下从蓝色变为粉红色，实现了灵敏的比色检测。有趣的是，相同的纳米粒子也被用于非酶促比色检测皮质醇，如图5C所示，突显了它们的多功能性。另一种策略是针对唾液中天然存在的酶。Silva-Neto等人报告了一种通过监测酶催化的淀粉-碘复合物的形成来量化α-淀粉酶活性的协议。类似地，Ferreira等人通过测量尿素酶水解过程中释放的氨引起的溴百里酚蓝的颜色变化来测量尿素酶活性。这些方法需要考虑不同唾液条件下酶浓度的变化，这可能会影响信号强度，并导致即时护理诊断结果的解释不一致。一个经典的例子是使用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖的比色检测，这在空腹或餐后状态下可能会产生不同的结果。非酶促反应虽然通常对某些临床筛查的特异性较低，但由于其简单性和广泛的适用性，在比色唾液分析中仍然非常相关。与通常依赖于特定生物相互作用的酶促方法不同，非酶促检测可以针对唾液中自然存在的分析物、通过毒性暴露引入的分析物或由宿主或相关病原体产生的代谢过程。一个代表性的例子是Srisomwat等人报告的乙醇检测，其中酸化的重铬酸钾作为氧化剂，将乙醇转化为乙酸，同时自身被还原为铬(III)离子（Cr3+），产生特征性的绿褐色。

在非酶促机制中，络合反应因其操作简单性和形成稳定有色产物的能力而脱颖而出。值得注意的例子包括用于亚硝酸盐检测的Griess反应（见图5D）、钙与甲基百里酚蓝（MTB）或结晶紫（MTB）的络合反应、以及使用Fast Blue B Salt（FBBS）检测THC的反应。尽管非酶促方法具有优势，但其较低的特异性在临床环境中可能会带来挑战，特别是在选择性对准确诊断至关重要的情况下。唾液中的其他相关离子，如硫氰酸盐和铁，也通过络合反应成功检测到。硫氰酸盐与铁离子（Fe3+）反应形成红棕色的[FeSCN]2+复合物，这是唾液中广泛使用的比色检测反应，如图5E所示，而铁本身可以使用显色配体（如1,10-菲罗啉）进行量化，后者与Fe2+形成橙红色复合物。比色检测提供了多种信号读出策略，每种策略根据应用背景具有不同的优势和局限性。最基本的方法是视觉检查，这是一种历史悠久的技术，不需要任何仪器设备，因此非常适合低成本、快速且用户友好的测试——尤其是在即时检测（POC）场景中。这种方法特别适用于定性或半定量评估，包括二元（阳性/阴性）测试，例如用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白的测试。视觉读数也常用于侧向流动分析中，目标分析物的存在通过测试区中的彩色线条来指示，如在SARS-CoV-2和流感病毒的多重检测中所展示的那样。

为了提高颜色解释的准确性和重复性，视觉检测通常会与数字图像比色法（DIC）结合使用或被后者取代。DIC涉及使用智能手机、扫描仪或网络摄像头等设备捕捉检测区的图像，然后使用图像处理软件对颜色强度进行定量分析。虽然这种方法提高了分析精度，但它需要一致的照明条件和图像标准化——如果这些因素没有得到仔细控制，可能会影响可靠性。平板扫描仪提供了出色的光照稳定性，但降低了便携性，而智能手机则提供了更大的灵活性，但通常需要定制的支架或光控箱来确保重复性。

一种新兴的替代方法是基于距离的检测（DBD），它将视觉简便性与量化相结合。在这种技术中，分析物通过含有比色试剂的微通道流动，形成一条与其浓度相关的彩色带。DBD可以在不使用仪器的情况下实现直接量化，但其在唾液诊断中的应用仍然有限。值得注意的应用包括使用直线通道检测白细胞介素，以及基于角度距离在半圆形通道中分析碘化物。

尽管比色法因其简便性而具有吸引力，但其灵敏度和量化范围与更先进的技术相比可能有限。这些限制促使人们将比色法与更敏感的平台（如电化学检测）集成或替代，特别是在需要精确生物标志物量化的应用中。此外，机器学习（ML）算法的集成已成为比色μPADs中的一个变革性策略，特别是在基于智能手机的分析平台中。除了补偿环境光变化和相机差异外，ML还能够从RGB和纹理特征中进行多维模式识别，从而提高信号区分度和分析稳健性。卷积神经网络（CNNs）、随机森林和集成学习模型在基于纸张的比色系统中表现出增强的性能，包括用于乳酸和葡萄糖检测的μPADs。

在基于唾液的应用中，由于基质复杂性、浑浊度和粘度会导致非线性信号失真，基于回归的ML方法通过建模复杂的数据关系而优于传统的线性校准。

4.2 电化学方法

电化学检测依赖于测量分析物与电极界面处发生的氧化还原反应产生的电信号，从而实现唾液中特定生物标志物的量化。这种技术包括伏安法、安培法、电位法和电化学阻抗谱（EIS）分析等多种方法，每种方法根据分析物的性质和唾液基质的特点提供不同的优势。其中，伏安法在唾液分析中应用最广泛，因为它能够提供高灵敏度和精确的测量结果。例如，循环伏安法常用于检测电活性化合物，而方波伏安法则用于检测苯胺。然而，差分脉冲伏安法是最常用的技术，特别适用于检测组胺、同型半胱氨酸、C反应蛋白和SARS-CoV-2刺突蛋白等生物标志物。

尽管伏安法仍然占主导地位，但在唾液诊断中也探索了其他电化学技术，尽管使用频率较低。安培法提供快速检测，常用于葡萄糖监测，而电位法在离子选择性检测中表现出有效性，例如用于萘普生。此外，EIS提供无标记检测，并已应用于识别猴痘病毒等病原体。

然而，电化学方法的一个关键挑战是它们要求分析物具有电活性。这一限制推动了开发策略，以增强非电活性分析物的电化学响应或使其副产物能够被检测到。一种方法是化学衍生化，其中目标分子（如苯胺）在原位转化为电活性化合物。另一种策略涉及电极表面修饰，可以包括固定特定试剂或纳米材料以提高灵敏度和特异性。例如，Diao等人开发了一种离子选择性电极，或者用共晶Ga–In和Au纳米粒子对电极进行功能化，以捕获针对同型半胱氨酸和C反应蛋白等生物标志物的适配体。

此外，基于适配体的传感器也获得了关注，通过分子识别提供高选择性，如在中检测组胺时所见。另一种有前景的方法是使用酶级联来放大电化学信号，其中酶（如氧化酶）产生电活性物质（如过氧化氢H2O2），然后与电极相互作用。这种方法已成功应用于葡萄糖和尿酸的检测，通过将葡萄糖氧化酶与氧化还原化合物（如氨基铁氰化物）结合进一步放大信号。

尽管电化学检测提供了改进的灵敏度，但由于唾液中的蛋白质和黏蛋白导致的电极污染仍然是一个持续存在的挑战。此外，除非实现完全集成的低成本电子设备，否则可能需要外部读取器或电位计，这可能会限制完全的去中心化。然而，电化学方法并不局限于独立技术。许多研究探索了将电化学检测与其他方法（如比色法）结合的混合系统。这些组合方法有可能克服每种方法的个别局限性，提高基于纸张的分析平台的稳健性和灵敏度。

4.3 检测技术的集成

在μPADs中集成不同的检测方法已成为一种增强灵敏度、特异性和整体分析稳健性的强大策略。通过利用每种技术的互补优势——例如比色法的视觉简便性和电化学检测的定量精度——这些混合系统有助于开发更高效、可靠和用户友好的诊断平台。这对于即时检测和自我监测场景特别有益，在这些场景中，易用性和快速结果至关重要。Fabiani等人展示了一种基于纸张的电化学免疫传感器，用于COVID-19检测，结合了使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的比色读数和安培检测。最初的颜色变化作为视觉指示器，表明试剂流动正确，并指导用户通过智能手机界面开始电化学测量。这种双重方法最小化了用户错误，同时保持了检测的可靠性。图6A中的示意图突出了设备功能。

在唾液分析的PADs中集成检测策略的例子。(A) Fabiani等人开发的双模式PAD示意图，其中TMB的比色反应指导用户通过智能手机界面进行后续的安培检测。(B) 基于木质压舌板的PAD，结合了比色（用于亚硝酸盐和硫氰酸盐）和电化学（用于葡萄糖和尿酸）检测，能够在无需样品预处理的情况下同时分析多种唾液生物标志物。分别转载自Fabiani等人和de Lima等人的研究，并获得许可。同样，Pungjunun等人结合了比色和电化学技术来检测唾液中的硫氰酸盐。在比色反应过程中形成的红棕色[FeSCN]2+复合物通过智能手机辅助的DIC进行量化，同一样本随后通过方波伏安法进行分析。这种顺序双重分析实现了比单独使用比色法更低的检测限，表明集成可以提高分析灵敏度。

除了性能提升外，检测方法的混合还实现了多重分析。Fotouhi等人报告了一种PAD，能够通过线性扫描伏安法和DBD测量同时检测多巴胺和碘化物。通过施加低电压来增强涉及形成蓝色碘-淀粉复合物的比色反应，从而在单一系统中结合了比色和电化学模式。进一步扩展这一概念，Sousa等人开发了一种μPAD，能够使用共享采样区和集成电极检测多种唾液分析物——包括乳酸、亚硝酸盐、pH值和α-淀粉酶。通过使用普鲁士蓝纳米粒子修饰的电极实现乳酸的电化学检测，而亚硝酸盐、pH值和淀粉酶则通过智能手机辅助的DIC进行测量。

在另一个例子中，Lima等人在商用木质压舌板上结合了两种检测模式，实现了葡萄糖、尿酸、硫氰酸盐和亚硝酸盐的同时测量，无需样品预处理，如图6B所示。虽然亚硝酸盐和硫氰酸盐是通过比色测量检测的，但葡萄糖和尿酸需要使用定制设计的电极进行计时安培检测。

4.4 其他检测技术

除了比色和电化学方法外，还探索了其他与μPADs结合的唾液分析检测方法。其中一种方法是荧光法，它使用荧光探针来检测唾液中的特定目标，提供高灵敏度和实时测量的能力。例如，荧光共振能量转移（FRET）技术已被用于高精度检测唾液中的生物标志物。

另一种新兴技术是电化学阻抗生物传感器，这是一种从电化学方法衍生出来的方法，它通过测量电极-样品界面由于与分析物相互作用而产生的电阻变化。这种方法特别适用于检测唾液中的蛋白质和细胞，为快速和敏感的检测提供了有前景的替代方案。此外，阻抗谱和拉曼光谱已在μPADs中用于非侵入性检测唾液中的生物标志物，允许在没有化学试剂的情况下高选择性地检测化合物。这些技术补充了传统方法，并为检测唾液样本中的多种分析物提供了更广泛的选择，有可能扩展μPADs在临床和即时检测中的适用性。选择检测技术取决于几个因素，但最关键的方面是目标分析物的化学性质。接下来，还应评估其他标准，如成本、设备要求和方法学限制。表1提供了常见检测方法的比较概述，突出了在选择适当的唾液生物标志物检测分析协议时通常考虑的关键参数。

表1 唾液分析PADs中检测方法的比较总结

| 检测方法 | 检测原理 | 所需设备 | 灵敏度和特异性 | 成本和简便性 | 样品准备需求 | 限制 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 比色法 | 分析物相互作用引起的颜色变化 | 无（肉眼或DBDa）；智能手机、扫描仪、相机和计算机用于DIC | 中等灵敏度（通常通过DIC增强）；酶促反应具有良好特异性；非酶促方法较低 | 非常低成本；高度简单 |
| 电化学法 | 电信号（电流、电位或阻抗的测量） | 电位计（台式或便携式）、智能手机或计算机和电极 | 高灵敏度，特别是使用修饰电极和适配体、酶或选择性电极时具有高特异性 | 高灵敏度和特异性；取决于所使用的技术 |
| 集成系统（比色法+电化学法） | 比色信号和电信号的结合用于交叉验证或提高灵敏度 | 需要设备（电位计+相机/智能手机） | 取决于技术（荧光读取器、显微镜或光谱仪） |
| 其他方法（荧光、显微镜和拉曼） | 检测荧光发射、阻抗变化或拉曼散射 | 通常需要额外的设备（荧光读取器、显微镜或光谱仪） | 成本和复杂性各不相同；通常为中等到高 |

5. 唾液生物标志物及其在临床诊断中的应用

使用μPAD的唾液诊断由于相比其他生物液体（如血液）具有几个显著优势而吸引了大量研究关注。

唾液收集是非侵入性的、无痛的，且无需专业人员或特殊设备即可轻松完成，从而降低了成本和患者不适。与血液不同，唾液不会经历纤维蛋白介导的凝固，这简化了样本处理并消除了处理过程中对抗凝剂的需求。此外，唾液相对容易操作，根据目标生物标志物和储存条件，室温下可保持分析稳定性长达24小时，在冷藏条件下可保持数天，具体取决于所关注的生物标志物。这些特性使得唾液成为进行生化和毒理学评估的理想生物流体。7 唾液具有多种生理功能，包括润滑、抗菌保护、食物团块形成、吞咽以及辅助言语。唾液分泌主要由三个主要腺体完成：腮腺、下颌下腺和舌下腺。这些腺体由浆液细胞和黏液细胞组成——浆液细胞产生水样分泌物，而黏液细胞则贡献了更浓稠、更具黏性的成分。4,157

平均而言，一个健康的成年人每天会产生大约600毫升的唾液。其成分主要是水（约占99%），混合有钠、钾和氯等电解质。此外，唾液还含有帮助消化的淀粉酶以及调节口腔微生物群的抗菌物质。其他成分还包括代谢副产物（如尿素、氨）、血液衍生物、牙龈沟液以及细菌及其代谢物。5,6

如表2所示，唾液因其易于收集且所需体积较小（1-4毫升）而具有显著优势。这使其非常适合快速和现场诊断。相比之下，血液采集需要更具侵入性的程序，而尿液和汗液虽然是非侵入性的，但需要更大的体积，并且可能受到pH值或盐分等更大干扰因素的影响。然而，唾液中的生物标志物浓度通常低于血液和尿液。尽管存在酶、黏蛋白和食物颗粒等常见干扰因素，唾液仍然是一个有前景的诊断工具，尤其是结合先进的传感器技术来检测特定生物标志物时。表2

生物流体及其适用于纸质分析设备的比较分析



特征
唾液
尿液
血液
汗液
参考文献
易于收集
非常容易（无需刺激）/容易（需要刺激）
容易
需要穿刺
容易
11



侵入性
非侵入性
中度侵入性
高度侵入性
非侵入性
12和158



收集体积
中等，通常1-4毫升
丰富
中等，约1毫升
低
62, 159和160



适用于纸质设备
非常适用
非常适用
适用（通常需要在设备中加入提取/分离模块）
适用
161-163



常见干扰因素
酶、黏蛋白和食物颗粒
盐分和pH值
血红蛋白和脂蛋白
盐分和pH值
145, 164和165



生物标志物浓度
中等
高
高
高
低
30, 109和166



5.1 唾液收集与处理

使用唾液进行诊断测试的主要优势在于其收集的便捷性和灵活性，可以使用塑料管、吸水拭子或市售的收集设备等简单工具完成。这种实用的方法特别适用于即时诊断（POC）应用，这些应用旨在无需实验室设施或专业培训人员即可提供快速的、分散式的诊断结果。在非临床环境中收集唾液的可行性扩展了纸质分析设备（PADs）的应用范围，使其非常适合在偏远地区或自我监测中使用。唾液可以通过两种主要方法收集：非刺激（或静息）唾液和刺激唾液。非刺激唾液主要在没有外部刺激的情况下由下颌下腺和舌下腺分泌。30 它反映了唾液分泌的基础状态，含有维持黏膜完整性、润滑和先天防御机制所必需的电解质、黏蛋白和抗菌蛋白等成分。11

相比之下，刺激唾液是在味觉、嗅觉或机械刺激（如咀嚼或品尝酸性物质）下产生的。这种类型的唾液主要由腮腺分泌，占总刺激流量的大约80%。它通常更稀薄，含有更高的碳酸氢盐浓度，有助于缓冲口腔中的酸性物质。5

收集后，唾液样本通常需要预处理以确保稳定性和分析准确性。常见的处理技术包括离心、过滤和冷冻保存，以及添加化学防腐剂以防止酶降解和微生物污染。11 在一些微型纸质分析设备（μPADs）应用中，唾液样本无需进行大量预处理。这主要是因为纸张的多孔结构与微流控通道结合后，可以自然保留某些干扰物质和颗粒物，从而简化了样本处理。然而，需要注意的是，根据目标分析物的性质，特别是在低丰度生物标志物或易降解分析物的情况下，可能仍需要预分析步骤，如过滤、稳定或选择性富集，以确保分析的可靠性和灵敏度。最近的研究表明，用于μPADs的纸张的固有孔隙性和毛细作用可以在流体迁移过程中选择性地保留颗粒物和潜在干扰物，使得未经处理的唾液样本可以直接用于许多即时诊断应用。Ferreira等人使用纸质设备成功量化了人体唾液中的硝酸盐和亚硝酸盐，而Chen等人强调，尽管纸质微流控技术可以简化甚至消除预处理步骤，但仍应根据目标分析物的物理化学特性和稳定性来评估是否需要这些步骤。167,168

在传统的实验室诊断中，唾液样本通常会先进行离心以去除细胞碎片，然后在-20°C或-80°C下储存，之后根据分析方法（如ELISA、HPLC、LC–MS/MS或RT-PCR）进行分析。因此，当提出μPADs作为替代方案时，其分析性能应理想地与这些参考协议进行比较，使用匹配的临床样本进行验证。2,48



5.2 唾液生物标志物

使用μPADs和唾液作为生物流体进行疾病诊断是一种有前景的方法，因为唾液中天然存在多种分析物，包括离子、抗体、微生物代谢物、激素、酶甚至整个微生物。145 这些唾液成分的浓度和组成与多种口腔和系统性疾病相关，包括感染性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病和肿瘤性疾病。此外，这些方法符合世界卫生组织（WHO）为理想即时诊断定义的ASSURED标准。169,170

唾液分析物可以根据其化学性质、诊断相关性和在疾病检测中的功能作用进行分类。表3根据这些生物标志物的化学特性和诊断目的进行了分类，并提供了文献中关于其在纸质设备应用的最新示例。根据化学性质对生物标志物进行分类，可以更有条理和针对性地回顾已有的研究结果，特别是考虑到某种疾病（无论是系统性的还是局部的）可能涉及多种生物标志物，这些标志物共同有助于更准确和全面的诊断。表3

根据化学性质和诊断作用对潜在唾液生物标志物的分类



生物标志物
临床相关性
唾液中的正常范围
主要相关技术
检测限（LOD）
参考文献
唾液pH值
反映一氧化氮通路活性及炎症、感染、心血管和牙周疾病的指标。
6.5–7.5
比色法指标
—
55



亚硝酸盐
反映一氧化氮通路活性及炎症、感染、心血管和牙周疾病的指标。
25–1000 μmol L?1
比色法检测（Griess方法）/电化学方法
0.05 μmol L?1/1.5 μmol L?1
167和171



硝酸盐
5–300 μmol L?1
比色法和电化学检测
0.08 mmol L?1/0.015 μmol L?1
167和172



镁（Mg2+）
参与骨骼健康、心血管功能、能量代谢和免疫反应。
0.1–0.5 mmol L?1
比色法检测
62 μmol L?1
113



铁（Fe2+）
10–30 μg dL?1
比色法检测
5.6 ppm
158



钙（Ca2+）
1.1–2.5 mmol L?1
比色法检测
2.9 mg L?1
124



磷酸盐
4–8 mmol L?1
比色法和电化学检测
26 μmol L?1/26.27 mg L?1
173和174



硫氰酸盐
氧化应激和烟草使用的标志物；在牙周疾病中升高。
0.2–2.0 μmol L?1
比色法和电化学传感器
6 μmol L?1
87



氨
反映肝脏和肾脏功能；有助于监测CKDa和微生物组平衡。
2–5 mmol L?1
通过气体扩散的μPADs进行比色法检测
0.03 mg dL?1
12



尿素
15–22 mg dL?1
通过脲酶活性进行比色法检测
10.4 mg dL?1
175



尿酸
与血清水平相关；有助于监测代谢和心血管状况。
30–240 μmol L?1
使用PEDOT-GOb纳米复合材料的比色法和电化学检测
0.75 μmol L?1
176和177



唾液淀粉酶
消化酶；在压力和胰腺疾病中升高。
20–100 U mL?1
比色法酶活性检测
0.75 U mL?1
91



乳铁蛋白
与牙周炎、阿尔茨海默病和全身性炎症相关。
2–5 mg L?1
比色法检测
110 μg mL?1
178



碱性磷酸酶（ALP）
与骨骼疾病、肝脏疾病和牙周疾病相关。
20–140 U L?1
比色法酶活性检测
1.69 U L?1
179



C-反应蛋白（CRP）
与心血管疾病、牙周疾病和糖尿病相关。
0–5 mg L?1
LFA
55 ng mL?1
180



白细胞介素-6
与炎症和癌症相关的生物标志物；参与组织降解和免疫反应。
1–50 pg mL?1
比色法检测
9.55 pg mL?1
181



肿瘤坏死因子α（TNF-α）
2–10 pg mL?1
电化学检测
5.97 pg mL?1
181



基质金属蛋白酶（MMPs）
变化范围（ng mL?1）
LFA和电化学检测
1.0 ng mL?1
182和183



皮质醇
与压力、代谢和心血管疾病相关；有助于追踪全身健康状况。
0–30 ng mL?1
电化学检测
0.81 ng mL?1
184



胆固醇
0.5–12 mg dL?1
比色法和阻抗法检测
<5 μg ml?1
185和186



葡萄糖
与糖尿病和代谢综合征相关。
0.5–1.0 μmol L?1
比色法和电化学酶活性检测
2.60 × 10?6 mol L?1
88, 187和188



乳酸
与败血症、缺氧、体力活动、代谢紊乱和细菌活动相关。
0.11–0.56 mmol L?1
电化学检测
8.14 × 10?7 mol L?1
188



结核病（TB）
唾液能够快速、无创地检测病原体。阴性/阳性
核酸扩增和比色法检测
1.95 × 10?2 ng mL?1
73



SARS-CoV-2
阴性/阳性
核酸扩增和LFA
30 ng mL?1
142和189



流感病毒
阴性/阳性
LFA、比色法和电化学检测
<5 PFU mL?1
190



醛类
氧化应激、口腔癌风险和物质使用的标志物。检测范围：20.4–114.0 μM
比色法检测
6.1 μmol L?1
191



酒精（乙醇）
0–0.05 g dL?1
比色法检测
未指定
146



可待因和芬太尼
适用于现场检测阿片类药物或兴奋剂的使用及监测戒断情况。检测水平因使用情况而异
LFA和电化学检测
可待因70 ng mL?1，芬太尼22 ng mL?1
192



甲基苯丙胺
阴性/阳性
电化学检测
<400 ng mL?1
193



5.2.1 酸和无机化合物

这一类别包括唾液中天然存在的小分子和离子，它们可以指示口腔和全身健康状况。例如唾液pH值、55 亚硝酸盐、16,61,171 硝酸盐、167,172 氨、12 磷酸盐、173,174 尿酸、176,177 以及金属离子，如镁（Mg2+）、113 钙（Ca2+）、124 和铁（Fe2+）。158

已经成功开发出基于纸张的设备来测量这些分析物。例如，作为pH值指示器的μPADs可以监测唾液pH值的变化，这通常与龋齿风险和牙周疾病有关。亚硝酸盐和硝酸盐的水平可以反映细菌活动或炎症状态，而钙和磷酸盐等离子则直接与牙齿脱矿或唾液腺功能相关。167,173 然而，尽管这些分析物易于分析，但基质效应（如离子强度的变化、酶降解或蛋白质吸附）可能会影响比色试剂的稳定性和反应性。临床上，这些分析物通常使用离子色谱法、分光光度法、酶测定法或自动化生化分析仪进行定量。例如，唾液中的尿酸和氨通常使用从血清分析中改编的酶比色试剂盒进行测量，而亚硝酸盐和硝酸盐则通过基于Griess的分光光度法或色谱技术进行定量。7,16,48,129

在系统性疾病背景下，针对这些分析物的μPADs在早期检测代谢紊乱甚至某些癌症方面显示出潜力。例如，尿酸和氨的水平已被探索作为代谢功能障碍和肾病的标志物，194 而更广泛的应用包括使用唾液谱型检测肺癌、口腔癌和乳腺癌。195–197

诸如缓冲预加载或使用亲水膜等策略可以帮助最小化基质相关的干扰，包括pH值的变化、粘度和生物污染效应。例如，Aguiar等人使用改良的纤维素纸展示了改进的分析性能，这种纸增强了样本传输并减少了基质干扰。112

用于同时检测多种离子（如磷酸盐和硝酸盐）的多重平台在区分系统原因和局部口腔状况方面具有临床吸引力。174 然而，确保在封闭测试区域内避免交叉反应仍然是一个技术挑战。使用分离微流控通道可以提高此类应用的选择性。124



5.2.2 蛋白质和酶

蛋白质和酶是一类更复杂的唾液生物标志物，需要更高的灵敏度和特异性。在常规临床实验室中，唾液中的蛋白质和酶通常使用ELISA或自动化免疫测定平台进行定量分析，这些方法具有高灵敏度和标准化的校准能力。在某些情况下，基于μPAD的检测方法与ELISA之间的比较显示出了强烈的线性相关性，尤其是在α-淀粉酶和CRP方面。2,198,199 最近的研究中，Silva-Neto等人展示了将唾液淀粉酶检测整合到基于纸张的格式中的成功案例，利用了酶-底物之间的颜色反应。91 虽然这些平台提高了对这类分析物的灵敏度，但在复杂的唾液基质存在的情况下，确保选择性检测仍然是一个挑战。119,184

这一领域的一个重要空白是缺乏标准化的抗体试剂和基质稳定技术，这限制了结果的重复性和保质期。多重蛋白质检测的潜力是巨大的，但仍然处于开发的早期阶段，常常受到交叉反应和信号重叠的制约。180

一个关键挑战是复杂的唾液基质，它可能导致非特异性结合和蛋白质降解，尤其是在不受控制的条件下。使用蜡印屏障或血浆分离膜的PADs可以有选择地保留蛋白质，同时去除干扰物质，从而提高特异性和可靠性。119

5.2.3 细胞因子和炎症生物标志物

炎症生物标志物如TNF-α、MPO和MMPs对于监测慢性炎症性疾病（包括牙周炎和自身免疫性疾病）非常有价值。尽管它们在诊断中具有重要意义，但很少有研究关注这些生物标志物在唾液中的超低浓度和不稳定性。临床上，细胞因子如TNF-α、IL-6和MMPs主要通过高灵敏度的ELISA或多重珠子免疫测定法进行定量分析。181–183

目前有几种设备正在开发中，用于检测唾液中的细胞因子，通常采用电化学免疫传感器。虽然上面没有列出针对特定细胞因子（如MPO或TNF-α）的参考文献，但许多来自蛋白质和酶检测研究的平台可以通过类似的方法适应于检测炎症介质。180,181

临床上，早期检测到升高的细胞因子水平可以显著影响慢性疾病（如牙周炎或舍格伦综合征）的监测。然而，这需要具有主动预浓缩步骤的μPADs，例如那些使用毛细管富集区或纳米粒子辅助信号放大的设备。这些策略在唾液诊断中的应用仍然处于探索阶段。200–202

5.2.4 激素和代谢物

激素和代谢物标记物因其与系统性疾病（如压力、糖尿病和心血管疾病）的直接关联而非常重要。在临床实践中，唾液中的皮质醇通常使用ELISA或化学发光免疫测定法进行测量，而葡萄糖和胆固醇则通过酶促比色法或自动化分析仪进行定量。40,48,129

不同作者开发的设备在非侵入性葡萄糖和皮质醇监测方面显示出了有希望的结果。然而，这些设备往往难以应对唾液激素水平的动态范围和时间依赖性变化，这可能限制了它们的独立诊断潜力。55,86,185

电化学传感平台的整合代表了向定量μPADs迈进的一步，尽管这样的系统必须解决与校准、稳定性和信号漂移相关的挑战。未来的临床应用将受益于连续监测格式或可穿戴集成，特别是在压力研究或糖尿病管理中，实时唾液读数可以补充连续血糖监测仪（CGMs）。187,189

5.2.5 病原体

病原体检测是涉及纸基微流控技术的研究中最具影响力的领域之一，特别是对于传播率高的疾病。COVID-19大流行突显了快速、基于唾液的诊断方法的关键作用。唾液中病原体检测的临床金标准通常包括用于病毒RNA的RT-PCR、用于细菌的培养方法或基于抗原的免疫测定。在COVID-19大流行期间，几种μPAD平台与RT-PCR进行了基准测试，并在受控队列中报告了高灵敏度。然而，病毒载量、样本处理和储存条件的变化可能会显著影响结果。在广泛临床应用之前，仍需要包括敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）在内的全面现场验证。4,9,156

Fabiani等人开发了一种智能手机辅助的μPADs用于SARS-CoV-2诊断，并证明基于纸张的格式可以提供适合大规模筛查的敏感结果。142 同样，Tsai等人和Bhardwaj等人分别描述了能够检测结核病和流感的基于纸张的设备。73,190

尽管这些设备具有很高的临床和公共卫生价值，但它们的性能通常在受控的实验室环境中进行评估。显然需要现实世界的验证研究，特别是在资源有限或社区环境中，这些设备最为需要。此外，与智能手机图像分析和连接工具的集成可以增强这些技术的影响，实现实时流行病学监测。重要的是要指出，唾液中含有核酸酶、黏蛋白和酶，这些成分可能会降解病毒成分。如果没有集成的样本处理步骤，如热裂解、过滤膜或pH稳定，这些测试的灵敏度和可靠性会下降。像Bhardwaj等人开发的那种包含纸基加热区和冻干试剂的设计，为更稳健的现场使用铺平了道路。190

5.2.6 药物和有毒物质

在法医和临床毒理学中，确认性分析通常使用GC-MS或LC-MS/MS进行分析，这些方法提供高选择性和法律上可辩护的结果。用于检测滥用药物（如甲基苯丙胺、乙醇和阿片类药物）的μPADs发展迅速，特别是在法医筛查和紧急诊断中。最近的例子包括展示了基于唾液的阿片类药物和乙醇检测的设备，具有出色的便携性和用户友好性。148,192,193

尽管采用预处理层、过滤步骤或选择性试剂的几种策略显示出前景，但仍存在重大挑战。诸如选择性有限、假阳性反应和基质干扰等问题继续影响分析的可靠性。需要进一步的进展来建立标准化的临界值，提高定量准确性，并最小化内源性唾液成分的干扰。193,203

5.3 克服唾液基质挑战的策略

由于唾液诊断可能受到分析前因素的影响，如粘度波动、稀释效应、酶促降解、黏蛋白相关的基质干扰以及临床相关生物标志物的低丰度，通过将样本处理集成到设备架构中并实现现场唾液分析，可以合理设计μPADs来缓解这些限制。23,44,106

多孔纤维素基质作为被动过滤层，在毛细流过程中保留较大的颗粒和黏蛋白聚集体。流量调节进一步有助于减轻唾液的变异性。4,204 通道几何形状、多层配置和嵌入式延迟元件可以调节反应时间和流体传输。当与之前讨论的阀门系统和3D μPAD架构结合时，这些方法允许在异质粘度条件下进行顺序反应并提高重复性。Liu等人报告了一种结合了μPAD检测的离心微流控盘，用于唾液SARS-CoV-2核衣壳蛋白的检测，实现了高效的样本预处理和低检测限（10 pg/mL），性能可与商业侧向流式测定相媲美。205 这说明了如何将机械预处理和基于纸张的传感技术结合起来，以应对唾液基质的复杂性。此外，试剂固定化和表面功能化策略提高了稳定性和选择性。尽管这些原理通常在基于尿液的设备中得到验证，例如Ferreira等人开发的酶促硝酸盐μPAD，但它们可以直接应用于唾液，在唾液中酶的稳定化和受控激活对于可重复的性能至关重要。194 这些例子表明，μPADs可以将分析前控制集成到其结构设计中，加强分析架构与实际唾液诊断之间的联系。

5.4 临床验证和基于队列的研究

虽然关于唾液μPADs的文献主要集中在分析优化上，但许多平台仍然主要依赖于模拟唾液来展示性能。61,170,190 这些研究对于定义传感机制、校准行为和基质兼容性至关重要，从而为该领域奠定了分析基础。然而，它们并没有直接解决在临床特征化人群中的转化适用性问题。

用于唾液分析的μPADs已经开始在真实唾液样本中进行评估，尽管通常是在较小的队列中（每组通常少于20个样本）。55,173,194 例如，Santana-Jiménez等人展示了直接应用于未经处理的唾液的二元酶基葡萄糖传感器的可行性。206 Ferreira等人报告了使用参考方法成功检测唾液中的硝酸盐和亚硝酸盐，167 Kumar等人在19个唾液样本中验证了磷酸盐μPAD，其结果与分光光度分析具有良好的相关性。173 在大多数情况下，主要目标是使用真实样本来证明设备的适用性，而不是进行统计上有意义的临床验证，诊断临界值、灵敏度和特异性指标仍然大多未定义。重要的是，唾液生物标志物的临床成熟度取决于所研究的病理情况。对于系统性疾病，基于队列的唾液标志物验证仍然有限且不均匀。4,5 相比之下，对于局部炎症性疾病（如牙周炎），唾液生物标志物在分层患者群体中得到了更一致的研究。6,11,12,18 Bezerra Júnior等人报告了慢性牙周病患者唾液中有机和无机化合物的显著变化，支持了基于唾液的评估的生物学合理性。207 同样，Almeida等人评估了具有颞下颌关节疾病的个体的唾液皮质醇，表明在设备导向的验证之前，已经对唾液中的生物标志物进行了研究。208

总的来说，这些发现揭示了文献中的不对称性：虽然几种唾液生物标志物已经进行了基于队列的临床研究，但基于μPAD的验证在类似人群中仍处于早期阶段。该领域显然正从分析概念验证转向转化评估，但仍需要生物标志物的临床证据与大规模设备验证之间的融合。统计上有意义的多中心研究对于将唾液μPADs巩固为可靠的诊断工具至关重要，特别是对于系统性疾病。209–211

5.5 当前的限制和转化挑战

尽管本文讨论了显著的进展，但几个限制仍然阻碍了唾液μPADs的全面临床转化。一个主要问题是功能化纸基基质的长期稳定性和保质期，特别是在基于酶和纳米粒子修饰的系统中，湿度、温度波动和氧化可能会影响分析性能。4–8

此外，由于纸张孔隙率、纤维分布、表面处理和手动试剂沉积的差异导致的批次间变异性可能会显著影响重复性，特别是在定量应用中。分析前的变异性也是一个关键障碍：唾液成分受水分状态、昼夜节律、刺激条件和收集协议的影响，但这些因素在不同研究中并未一致标准化。12

尽管已经报道了许多概念验证设备，但直接将μPADs与金标准实验室技术进行比较的大规模临床验证研究仍然有限。解决这些挑战将需要标准化的制造工作流程、统一的唾液收集协议、在现实世界条件下的稳定性研究以及统计上有意义的临床评估，以确保监管接受和实际应用。

6. 未来展望

与血液、尿液或其他体液相比，唾液被认为稳定且易于处理，但它根据个体及其自身习惯表现出动态行为。唾液非常适合现场测试，非常适合即时诊断（POC）应用。在本节中，将讨论使用μPADs进行唾液测试的趋势，重点关注便携式和数字传感器以及可以进一步集成到物联网（IoT）框架中的设备。我们还将讨论用于检测和预测各种人类疾病的新兴传感策略。

6.1 与数字技术的集成

物联网技术引入了新的POC分析设备前沿，使得诊断解决方案更加集成、易于访问和分散。212 在物联网工具中，智能手机作为特别多功能的平台脱颖而出，因为它们配备了各种传感器、执行器和通信模块，可以实现实时数据采集、处理和传输。212–214 虽然μPADs上的比色检测可以使用标准智能手机相机轻松完成，但电化学检测通常需要使用电位计。为了满足这一需求，近年来便携式和开源电位计的开发取得了显著进展，特别是在几项开创性研究证明了它们在资源有限环境中的可行性和有效性之后。214

便携式和微型化的电位计最初是为与便携式设备结合用于汗液分析而开发的，为非侵入性和连续分析体液样本打开了大门。212–218 这一创新促进了各种手持式和开源电位计的发展，例如PalmSens和Io-Rodeo提供的设备，以及学术研究中报告的低成本定制设备。例如，Anshori等人设计了一种低成本的便携式电位计（21.4美元），支持多种电化学技术，包括CV、LSV、SWV、DPV和chronoamperometry，其性能可与商业系统相媲美（平均准确率>90% vs. EmStat Pico）。值得注意的是，它还支持使用三个同时通道的半并行分析。218

特别是对于唾液分析，便携式、电池供电和无线电位计的需求非常高，特别是在POC应用中。正如Bianchi等人所展示的，将电位计集成到基于物联网的生物传感器系统中，可以实现自主操作和基于云的数据处理，这一特性对于分散式诊断至关重要。他们的设备无需智能手机或个人电脑即可独立运行，通过网页界面直接提供Wi-Fi连接和基于机器学习的校准功能。同样，Ferreira等人开发了PULSE系统，这是一个快速且微型化的实验室现场电化学平台，能够以高精度（97.6%）进行计时电流法和循环伏安法，并在短短2秒内快速检测pH值，强调了其在实时分析中的实用性。

尽管这些设备最初并不是为唾液分析而设计的，但它们在真实生物基质（例如汗液、血液或人工液体）中的表现表明它们是适应这一用途的强大候选者。然而，由于唾液复杂的基质和潜在的干扰因素，以及其酶活性，任何此类适应都必须考虑诸如微流控分离或选择性膜集成等策略。这些适应措施对于保持信号稳定性和确保准确检测生物标志物是必不可少的。此外，实现物联网功能（如实时数据上传、无线通信和人工智能辅助解释）对于智能诊断至关重要，特别是在COVID-19大流行等紧急健康情况下。虽然可穿戴电化学传感器在汗液监测方面取得了显著进展，但类似的唾液分析系统仍然是一个尚未完全探索的前沿领域——这需要微型化、防止生物污染和实时数据传输。这些技术进步也将基于物联网的μPAD系统纳入了当代REASSURED框架，用于即时诊断。该框架最初定义为ASSURED，后来扩展为包括实时连接和样本采集的便利性。在这种背景下，结合唾液采样、便携式读数、无线通信和基于云的处理直接解决了REASSURED框架的多个维度，超越了可负担性和用户友好性，包括了由连接性驱动的数据整合。这种一致性增强了基于μPAD系统的潜力，使其能够用于大规模筛查、纵向监测，并整合到数字健康基础设施中，最终加强了它们对临床决策和实时公共卫生监测的贡献。然而，实现完全去中心化不仅需要数字连接，还需要操作自主性。虽然基于物联网的μPAD解决了数据传输和整合问题，但对外部电源的依赖仍然限制了它们在资源受限或偏远地区的部署。在这种情况下，自供电μPAD作为一种补充策略出现，旨在消除能源依赖并实现完全自主的分析平台。

6.2

朝向完全自主和自供电的μPAD平台

自供电μPAD代表了一种新兴策略，通过在同一设备架构中集成流体处理和能量生成来实现完全自主的分析平台。在纸质系统中，自主操作本质上是由毛细微流控技术促成的，该技术利用表面张力、粘度和压力梯度等物理力量来驱动流体流动，无需外部泵来控制时间、方向和流速。

Fischer等人展示了自供电传感器的实现，他们开发了一种3D折纸酶燃料电池，在其中葡萄糖氧化直接在传感器内部产生分析电流，消除了对外部电源的需求。同样，Pal等人集成了一种摩擦电发电机，实现了用户激活的能量收集，以供定量传感使用。Mohammadifar和Choi展示了一个特别相关的进展，他们报告了一种基于冻干的外源电细菌的唾液激活纸质生物电池，这些细菌预先接种在纸上。只需一滴唾液重新水化，微生物燃料电池就能在几分钟内产生足够的电力来驱动芯片上的电子设备。冻干细菌延长了保质期，而在单张纸上串联集成多个电池则增强了功率输出。这项工作强调了唾液不仅作为诊断液体的潜力，还作为直接能源触发器的潜力，进一步强化了完全自主、一次性的纸质平台在即时诊断应用中的概念。

6.3

可穿戴设备和唾液收集

唾液是一种有吸引力的生物流体，用于诊断，因为它非侵入性、无压力收集，且只需最少的培训即可自行完成。尽管有这些优势，唾液分析仍需要仔细收集，以避免食物残渣、血液痕迹和口腔细菌的干扰，尤其是对于低浓度生物标志物。目前还没有标准化方法，商业工具包括拭子、漏斗、干燥点卡和被动唾液收集器。使用Whatman 903卡等材料的干燥点方法特别适合μPAD，因为它们可以处理小体积（10-100 μL）的样本。对于更精确的采样，像Lashley杯这样的设备专门用于从腮腺导管收集唾液。

可穿戴唾液传感器特别适合连续生物标志物的监测。尽管纸张尚未被广泛用作可穿戴唾液平台的核心传感元件，特别是那些设计用于连续或实时监测的平台，但它仍然是一种非常有前景的材料。其固有的生物相容性、自然吸收能力、低成本、可丢弃性以及与比色和电化学检测方法的兼容性，使得纸张成为开发轻便、灵活和用户友好型可穿戴系统的理想选择。与现有材料竞争之外，基于纸张的架构可能提供互补的优势，可以在未来的可穿戴唾液生物传感技术中战略性地加以利用。图7展示了这一类别中的代表性设备。其中，Arakawa等人介绍了一种牙套生物传感器，其中醋酸纤维素作为选择性过滤膜，而不是传感元件本身，有效减少了来自唾液成分（如尿酸和抗坏血酸）的干扰，从而提高了电化学葡萄糖检测的特异性。

6.4

新兴生物标志物

最近，人们对识别唾液中的新兴生物标志物越来越感兴趣，这些标志物可用于检测系统性疾病、神经系统疾病、癌症和压力。一个特别有前景的研究领域是开发检测细胞外囊泡（EVs）的方法，这些囊泡对于理解人类健康至关重要。EVs是参与细胞通信的脂质双层实体，可用于诊断和监测多种疾病，包括牙周病、口腔癌、原发性Sj?gren综合征和神经系统疾病。这些囊泡由各种类型的细胞分泌，可以在血液、尿液和唾液中找到。在EVs中，外泌体（直径30-150纳米）特别有作为生物标志物的潜力，因为它们在疾病监测中的作用以及其保护结构，可以防止其内容物被外源酶和恶劣环境条件降解。外泌体携带有价值的生物分子，包括可溶性和膜蛋白、RNA和DNA。近年来，纸张已被用于设计便携且成本效益高的外泌体分析设备。分析技术，如侧向流动测定、发光共振能量转移和基于距离的测定，已被用来通过靶向其膜上的簇分化（CD）分子来检测外泌体。例如，基于距离的测定通过聚二乙炔颗粒检测外泌体聚集，并通过视觉分析溶剂迁移。虽然这些方法对外泌体身份提供了有用的见解，但检测外泌体内的核酸（如miRNA）因其潜在的早期癌症检测和筛查能力而受到关注。Guo等人提出了一种基于笔的纸质芯片，用于检测乳腺癌来源的外泌体miRNA-21。尽管有这些进展，但在唾液样本中使用μPADs进行外泌体检测仍然是一个未充分探索的领域。仍然需要制定协议来解决样本制备、外泌体分离和检测问题，以便在临床应用中进行有效分析。

6.5

标准化和监管途径

尽管基于μPAD的唾液诊断技术取得了显著进展，但将实验室原型转化为临床批准的设备仍然具有挑战性。主要障碍之一是缺乏收集、存储和处理唾液的标准化协议。采样方法（例如，刺激性与非刺激性唾液）的差异、昼夜波动以及生物标志物浓度范围的差异使得研究间的比较变得困难，并阻碍了大规模验证。

此外，必须解决设备制造的重复性问题，包括纸张批次变化、试剂固定一致性和存储稳定性，以确保分析的稳健性。建立标准化的性能指标（检测限、灵敏度、特异性和与参考方法的临床一致性）对于监管批准和跨平台的有意义比较至关重要。从监管角度来看，基于μPAD的诊断设备必须符合区域框架，例如美国的FDA批准或欧洲体外诊断法规（IVDR）下的CE标志。最近的COVID-19大流行突显了快速、可扩展诊断平台的战略重要性，其中许多平台依赖于基于纸张的侧向流动技术作为大规模筛查的基础工具。实际上，基于纸张的诊断在概念上并不新鲜。商业妊娠测试是全球最成功的诊断工具之一，它依赖于基于纸张的微流控格式和比色检测，提供了简单性、稳健性、可重复性和低成本。其广泛采用表明，当有明确的临床需求和标准化的验证过程支持时，基于纸张的技术可以实现监管批准、市场渗透和持续的社会影响。

因此，弥合学术创新和监管合规之间的差距将需要在设备开发期间早期整合质量控制、临床验证和制造考虑。化学家、临床医生、工程师、监管专家和行业合作伙伴之间的跨学科合作将是将有前景的μPAD原型转化为可靠、可扩展和临床批准的诊断工具的关键。

7. 结论

基于纸张的微流控设备经历了显著进步，从依赖简单颜色条检测的初级平台发展成为复杂的芯片实验室系统。这些改进主要得益于微技术的发展，使得采用高精度技术成为可能，如光刻技术——这些技术曾经仅限于洁净室环境——后来过渡到使用便携式工具的更易获取的制造方法，包括手动打印机、注射器、热压机，甚至重新利用的儿童玩具。这种适应性赋予了这些平台前所未有的多功能性，使其成为临床诊断的强大工具，特别是在资源有限的设置和即时诊断应用中。随着对非侵入性诊断方法需求的增长，μPADs越来越多地被用于唾液分析。正如本综述所强调的，唾液包含广泛的生物标志物——蛋白质、激素、酶、代谢物、microRNAs和电解质——反映了系统性的生理和病理状态，使其非常适合诊断癌症、病毒感染、代谢紊乱、心血管疾病和口腔健康问题。通过基于纸张的设备进行唾液诊断与WHO为全球健康诊断建立的ASSURED标准高度一致。最近，向REASSURED框架的演变进一步增强了基于物联网和唾液的μPAD平台在当代分散式医疗模型中的相关性。可获取技术和紧急临床需求的结合使得μPADs成为前线医疗服务和紧急健康场景的有希望的解决方案，特别是在服务不足的地区。虽然一些唾液生物标志物（如乳铁蛋白、皮质醇和淀粉酶）已经得到很好的建立，但许多其他标志物仍然是一个“黑箱”，需要更精确的筛查和稳健的临床验证。在单个样本中多重检测几种生物标志物（例如，在癌症、糖尿病、肾脏疾病和牙周病的诊断中）使得诊断更加准确和敏感。然而，仍然存在重大挑战，包括生物标志物浓度的标准化、将样本预处理步骤（如过滤、提取和浓缩）整合到单一设备中、开发完全独立于智能手机或外部读取器的设备，以及减少复杂样本中生物成分的干扰。多重生物分析和高度特定和敏感传感器的进步代表了提高μPADs在现实世界临床样本中可靠性的有希望的方向。随着功能材料、微制造和设备微型化的持续创新，基于纸张的分析技术预计将在民主化早期诊断和推进全球公共卫生方面发挥越来越重要的作用。同时，唾液诊断在μPADs上的成熟度不断提高，为商业化开辟了有希望的途径，特别是由于它们提供了低成本、用户友好的替代方案，与传统实验室诊断相比。它们的便携性、简单性和快速提供结果的能力使它们特别适合直接面向消费者的应用、家庭测试套件和远程健康集成。当与数字连接基础设施结合时，这些平台可能支持可扩展的筛查程序、纵向监测和基于数据的实时临床决策，巩固了它们在现代POCT框架中的地位。随着监管途径的日益明确以及制造规模的扩大，这些设备在颠覆传统诊断市场以及在全球范围内推广个性化、预防性医疗保健方面具有巨大潜力。作者贡献：

Lucas R. Sousa：概念构思、形式分析、研究方法、数据可视化及初稿撰写。
Larissa G. Velasco：概念构思、形式分析、研究方法、数据可视化及初稿撰写。
Sandra G. Vlachovsky：概念构思、形式分析、研究方法、数据可视化及初稿撰写。
Federico Figueredo：概念构思、项目监督及审稿编辑。
Eduardo Cortón：概念构思、项目监督及审稿编辑。
Wendell K. T. Coltro：概念构思、资金筹集、项目管理、项目监督及审稿编辑。

利益冲突：

作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性：

本综述未包含任何原始研究结果、软件或代码，也未生成或分析任何新数据。

致谢：

作者感谢CNPq（资助编号308136/2025-0和406309/2025-6）、CONICET、国家科学技术促进局（ANPCyT）（资助编号BID-PICT 2020-04023）以及INCTBio（资助编号408338/2024-5）提供的财务支持、奖学金和研究资助。