生物活性壳聚糖支架，通过添加羟基磷灰石和钨酸镍进行增强，用于骨组织工程

《Biomaterials Science》：Bioactive chitosan scaffolds reinforced with hydroxyapatite and nickel tungstate for bone tissue engineering

　　当前的骨组织工程（BTE）支架往往无法同时提供足够的机械性能、可控的离子释放和多功能生物活性，特别是在加入可能引起细胞毒性的无机抗菌剂时。解决这一限制需要能够调节细胞反应而不损害结构完整性的生物活性添加剂。在这项工作中，通过冷冻干燥制备的壳聚糖/羟基磷灰石复合支架被NiWO4纳米颗粒功能化，用于BTE。羟基磷灰石的添加量为10 wt%，而NiWO4的添加量分别为2.5、5和10 wt%。结构分析确认，无机相的加入并未引起聚合物基质的结构变化。然而，热分析显示这些填料调节了壳聚糖-水之间的相互作用，促进了从层状结构向更互联的多孔网络的形态转变，这直接影响了支架的机械性能。离子释放研究表明，NiWO4不影响Ca2+的释放，而在较高NiWO4含量下，羟基磷灰石增强了Ni2+的释放。使用MC3T3-E1和L929细胞的生物测定表明，只有在含有10 wt% NiWO4的支架中，在14天后才观察到细胞毒性。尽管NiWO4在最初的24小时内引起了细胞内氧化应激的增加，但这种效应随时间减弱，尤其是在较低浓度下。含有2.5 wt% NiWO4的支架协同增强了MC3T3-E1的迁移、成骨分化和矿物质沉积，而羟基磷灰石改善了细胞粘附。此外，NiWO4还赋予了抗菌活性，通过可控的Ni2+释放和ROS生成，实现了高达90%的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。总体而言，这种混合支架代表了BTE的一个有前景的平台。

1. 引言

合成替代品的发展用于修复关键组织损伤仍然是材料科学和生物工程交叉领域最大的挑战之一。在这种情况下，骨组织工程（BTE）作为一个专门领域应运而生，专注于开发具有组织特性的生物活性支架，以克服当前临床治疗的局限性。支架的有效性不仅取决于材料的化学组成，还取决于确保适当机械性能、可控孔隙率和互连性的结构设计。这种结构组织对于提供必要的地形和生化刺激以促进细胞反应至关重要，协调粘附、增殖和成骨分化过程，这些都是新血管形成和功能性骨生成的关键点。

使用基于复合材料的支架是BTE的一个非常有前景的策略，特别是当这些支架由含有生物活性颗粒的聚合物基质构成时。这种组合允许模仿骨组织的混合性质，结合了聚合物易于加工的优点以及功能性填料所赋予的机械性能和生物活性优化。这些结构的成功与所采用的生物制造过程有关，在这种情况下，冷冻干燥是一种常见且高度可重复的技术，保证了对支架结构的严格控制。根据Angraini等人的研究，这种方法能够提供机械性能，既能提供结构支持，又能提供调节细胞行为所需的物理刺激。孔隙结构、生物相容性和机械稳定性之间的整合建立了一个有利于细胞-基质相互作用和成骨分化的微环境，这是设计用于骨再生的支架的基本要求。

壳聚糖由于其生物特性和易于加工的特性，在BTE中已被广泛研究作为聚合物基质。壳聚糖的优势包括天然来源、高度生物相容性和可生物降解性，以及易于修改，从而允许其与生物系统安全互动。其化学功能性和阳离子特性使其能够与细胞和生物分子相互作用，从而增强细胞反应和骨基质矿化。然而，单独使用壳聚糖可能无法提供足够的结构稳定性和生物信号来完全支持复杂的骨再生过程。为了解决这些限制，人们广泛探索了复合策略，旨在通过加入无机相来调整结构稳定性和生物功能性。Piszko等人强调，获得含有羟基磷灰石的壳聚糖复合材料可以增强生物活性和细胞渗透性，从而改善成骨性能。

羟基磷灰石占骨骼无机成分的60-65%，是BTE的关键材料。由于其元素和结构与骨矿相相似，羟基磷灰石表现出独特的生物特性，特别是其生物相容性、骨传导性和无免疫反应。这些属性有利于细胞粘附、成骨细胞增殖和间充质干细胞分化，巩固了其在移植物和支架中的应用。然而，羟基磷灰石的生物性能与其机械局限性形成对比，如低断裂韧性和固有的脆弱性，这限制了其在承重部位的单独使用。因此，在混合支架中，羟基磷灰石主要用作生物活性相来刺激细胞反应和矿化过程，而机械性能主要取决于支架结构和聚合物-陶瓷相互作用。在这种背景下，混合系统的结构设计旨在结合羟基磷灰石的生物活性和聚合物基质提供的结构支持。此外，还探索了加入功能性无机相作为引入额外功能的策略。Silva等人获得了含有AgVO3的羟基磷灰石异质结构，使这种复合材料对金黄色葡萄球菌（包括耐甲氧西林的MRSA和敏感的MSSA）具有抗菌性，并且获得了蓝白色光发射。Zhou等人证明，基于Zn掺杂的HA涂层可以提供防腐蚀保护，并同时促进强大的抗菌活性和成骨潜力。因此，这些混合系统通过引入超出其固有生物活性的治疗功能，扩展了基于羟基磷灰石的支架的功能潜力。

基于加入功能性无机相的策略，镍（Ni）基材料在BTE中引起了人们的兴趣，被视为有前景的候选材料。尽管在高浓度下镍的安全性需要关注，但其生物效应严格依赖于剂量；在微量水平下，Ni2+离子参与重要的生化过程，表明在适当控制下具有重要的生物作用。Horie等人证明，Ni2+离子引起的细胞毒性阈值约为50 μg mL?1（约0.386 mM）。虽然基于钛的材料因其长期生物相容性而广受认可，但仍然基本上是生物惰性的，而基于铜的系统提供显著的抗菌活性，但高度依赖于释放动力学，镍基材料处于中间位置，可以通过严格的剂量控制实现生物调节。这种双重性使得镍不仅可以用于结构增强，还可以作为细胞反应的调节剂，为开发具有先进功能和优化生物相容性的支架铺平了道路。TiNi合金在改善机械性能以及提供抗菌性能方面显示出潜力。此外，还有报道指出将Ni2+离子加入羟基磷灰石基质中，表明对磷酸钙的形成有积极影响，有利于骨基质矿化，促进骨组织恢复。此外，Ni2+还可以刺激血管形成，这对骨组织再生是必要的。在基于镍的材料中，钨酸镍（NiWO4）可能是一个改善壳聚糖和羟基磷灰石支架生物活性的良好选择。这是因为(WO4)2?为材料提供了稳定性，而不改变其生物活性，允许产生活性氧（ROS）和可控的Ni2+释放，同时还可能为支架添加抗菌性能。因此，整合羟基磷灰石/壳聚糖/NiWO4被认为是开发结合骨传导性和抗菌功能的先进结构的合理方法。为了验证这一策略，采用了系统的表征方法，包括结构、形态、热和机械分析，以及离子释放和生物评估。这种方法允许直接验证组成和支架结构如何影响生物活性、稳定性和细胞反应，确保实现所需的多功能性能。

2. 材料和方法

2.1. NiWO4的合成

NiWO4纳米颗粒是使用微波辅助的水热法合成的，遵循Grasser等人报告的程序。首先，准备了两种独立的溶液：一种含有1 × 10?3摩尔的硝酸镍（Ni(NO3)2·6H2O，98%，Sigma-Aldrich），另一种含有1 × 10?3摩尔的钨酸钠（Na2WO4·2H2O，99%，Neon），两者都溶解在50 mL中并持续搅拌。完全溶解后，将镍溶液加入钨酸盐溶液中，形成绿色悬浮液。然后将混合物转移到特氟龙内衬的反应器中，并在160 °C下进行8分钟的微波照射（2.45 GHz，800 W）。反应结束后，通过离心收集沉淀物，用蒸馏水洗涤五次，随后在60 °C的常规烤箱中干燥12小时。

2.2. 羟基磷灰石的合成

羟基磷灰石颗粒是通过化学沉淀法合成的，遵循Machado等人描述的程序。首先，准备了50 mL含有10 mmol Ca(NO3)2·4H2O（99%，Sigma-Aldrich）的水溶液和100 mL含有6 mmol (NH4)2HPO4（>98%，Strem Chemicals）的溶液。使用NH4OH（P.A., Synth）将两种溶液的pH值调整到9.5–10。准备完成后，将磷酸盐溶液以7 mL min?1的流速逐滴加入钙溶液中。磷酸盐溶液完全加入后，混合物在持续搅拌和加热下保持2小时。过程结束时，将得到的沉淀物用Milli-Q水洗涤八次，然后用乙醇洗涤三次。最后，将获得的粉末在60 °C的烤箱中干燥24小时。

2.3. 基于壳聚糖的复合支架的制备

基于壳聚糖的支架是通过冷冻干燥法制备的。简而言之，1克壳聚糖（Sigma-Aldrich，中等分子量（90–375 kDa），脱乙酰度：75–85%）溶解在100 mL 0.5%（v/v）醋酸溶液（Sigma-Aldrich，>99.7%）中，在室温下磁力搅拌24小时直至聚合物完全溶解。随后使用0.1 M NaOH（Sigma-Aldrich，97%）逐滴调整所得溶液的pH值至6.0，使用校准的pH计进行监测。通过将聚合物溶液模制成24孔板获得纯壳聚糖支架。对于复合支架，将羟基磷灰石以相对于壳聚糖10%的重量浓度加入壳聚糖溶液中。在加入之前，所有无机相（羟基磷灰石和/或NiWO4）使用探针型超声波发生器在20 kHz和750 W下分散在5 mL去离子水中，施加50%的标称功率2分钟，以降低粘度并促进在聚合物基质中的均匀分布。此过程后，系统在磁力搅拌下保持10分钟以确保颗粒均匀分布。对于不含无机填料的支架，额外加入等量的5 mL去离子水以保持所有配方中的固体含量和加工条件一致。含有NiWO4的支架通过按照相同的超声程序以2.5、5和10%的重量浓度加入NiWO4来制备。支架分别命名为纯壳聚糖（Ch）、壳聚糖/羟基磷灰石（ChHA）、壳聚糖与钨酸镍（Ch2.5NiW、Ch5NiW和Ch10NiW）以及壳聚糖/羟基磷灰石/NiWO4化合物（ChHA2.5NiW、ChHA5NiW和ChHA10NiW）。均质化后，系统浸入液态N2中15分钟以诱导瞬时冻结，然后在?70 °C下使用TERRONI LS 6000 B冷冻干燥机在0.06 mbar的真空下冷冻干燥72小时。

2.4. 表征

使用Rigaku diffractometer（型号DMax2500PC）进行X射线衍射（XRD），在40 kV、150 mA下使用Cu Kα辐射（λ = 1.5406 ?）。扫描范围为10°至80°，扫描速率为2° min?1。傅里叶变换红外（FTIR）光谱在衰减全反射（ATR）模式下记录，使用Spectrum Two光谱仪在400至4000 cm?1的光谱范围内进行，以识别官能团并研究组分之间的可能相互作用。通过扫描电子显微镜（SEM）观察支架的形态和微观结构，图像由JEOL公司的7500F型冷场发射扫描电子显微镜捕获。分析在SE模式下进行，加速电压为2 kV，发射电流为10 μA，放大倍数为50,000×。对于单独的无机相，使用15 kV的加速电压以提高图像分辨率和信号质量。对于能量分散光谱（EDS）映射，加速电压调整为15 kV以确保足够的元素激发。在扫描电子显微镜（SEM）样品制备过程中，粉末样品通过超声搅拌分散在去离子水中，然后取10 μL的悬浮液滴涂在硅基底上，在常温条件下干燥后进行分析。支架样品在成像前直接粘贴在铝制杆上的碳粘合带上。透射电子显微镜（TEM）图像是使用Jeol JEM-2100 F设备在200 kV下获得的。通过X射线荧光光谱仪（XRF，使用Mini-X2光谱仪）评估了支架的元素组成，特别关注钙和磷的含量。差示扫描量热法（DSC）用于评估热性能，量热仪的工作温度范围为-50至400 °C，使用铝坩埚，加热/冷却速率为10 °C min?1，氮气流量为0.50 cm3 min?1，设备为DSC204（Netzsch，德国）。支架的机械性能是通过使用配备500 N负载细胞的万能试验机（Instron，型号5582）进行单轴压缩测试来确定的。测试按照ASTM D1621标准（适用于多孔冻干支架）进行，十字头移动速度为0.5 mm min?1（n = 10）。圆柱形样品被压缩至其原始高度的50%。压缩强度是根据支架结构崩溃前记录的最大应力计算得出的。应力值是通过将施加的负载除以每个样品的初始横截面积来得出的。通过在模拟体液（SBF）中监测支架的稳定性来评估其性能，方法是通过测量pH变化和支架质量（n = 3）。支架被放置在含有5 mL SBF的12孔板中，确保整个多孔结构完全浸没在液体中。板子保持封闭状态，并在37 °C下孵育以防止实验期间介质蒸发。在孵育1天、7天和14天后，将支架从SBF中取出，用蒸馏水轻轻洗涤以去除残留盐分，然后冻干并称重以确定随时间的质量损失。在孵育1天、7天和14天后，通过SEM分析进一步评估了浸没后的表面形态和结构完整性。此外，在与液体接触1天、7天和14天后，使用高分辨率连续源分子吸收光谱仪（HR-CS MAS，使用ContrAA 300光谱仪，Analytik Jena，n = 3）量化释放的分析物。为了确定孔隙率，采用了Sousa等人提出的溶剂置换法。42 首先称量支架的质量，然后将其浸入乙醇中1分钟。孔隙率的计算公式如下：

(1)

其中Ww是支架的湿重，Wd是支架的干重，ρ是溶剂的密度，R是支架的半径，T是支架的厚度。

2.5 体外实验

2.5.1 细胞培养

使用来自里约热内卢细胞库（BCRJ）的MC3T3-E1前成骨细胞和L929小鼠成纤维细胞进行体外实验，以评估基于壳聚糖的支架的生物性能。这些实验按照ISO 10993-5:2009标准进行。细胞在含有α-MEM（VitroCell）的培养瓶中扩增（对于MC3T3-E1）或DMEM（VitroCell）（对于L929），两者都添加了10%的胎牛血清（FBS，VitroCell）和1%的抗生素-抗真菌溶液。细胞在37 °C、5% CO2的湿润气氛中维持，并每周传代一次，直到用于实验。

2.5.2 间接接触测试材料的准备

在生物实验之前，支架在无菌条件下暴露于紫外线辐射下灭菌24小时。生物相容性评估遵循ISO 10993标准，采用两种不同的方法：直接接触和间接接触。43 在直接接触方法中，细胞直接接种在灭菌后的支架表面上。对于间接接触方法，使用质量/体积比为0.1 g mL?1的提取物（条件培养基）进行制备。支架浸入培养基（DMEM或α-MEM，取决于细胞系）中，其中添加了10%的FBS，并在37 °C、5% CO2的湿润气氛中孵育24小时。之后，提取物通过0.22 μm膜过滤，以确保在细胞测试前去除任何杂质。

2.5.3 代谢活性

MC3T3-E1前成骨细胞和L929小鼠成纤维细胞系按照不同的方案进行代谢活性测试，包括直接和间接测试。在这两种情况下，细胞最初以每孔1 × 104个细胞的密度接种在48孔板中。在间接测试中，细胞培养24小时以允许完全粘附。之后，移除原始培养基并替换为500 μL的条件培养基。对于直接测试，支架预先放置在孔中并浸入500 μL的完整培养基中4小时，确保多孔结构完全吸收培养基并达到材料的水解平衡。只有在这段时间之后，细胞才直接接种在支架表面上。代谢活性通过在1天、3天和7天时使用resazurin试剂进行监测（直接方法）以及1天、7天和14天时（直接和间接方法）进行监测。在每个时间点，培养基被替换为200 μL的resazurin溶液（70 μM），并在37 °C下孵育4小时。荧光使用GloMax微孔板读数器（Promega）测量（激发波长520 nm，发射波长在580至640 nm之间），结果以相对于未经处理的对照组的百分比表示。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。

2.5.4 细胞内ROS

细胞内ROS的生成使用荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，Sigma-Aldrich）进行评估。MC3T3-E1前成骨细胞在相同的实验条件下接种在48孔黑板中，采用间接接触方法。粘附24小时后，施加处理。在暴露的第1天、7天和14天，细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，然后加入200 μL的100 μM DCFH-DA溶液。培养板在37 °C、5% CO2的湿润气氛中孵育30分钟，避光。之后移除探针溶液，并用PBS洗涤孔，然后加入100 μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Vitrocell）。荧光强度使用BioTek微孔板荧光计（Promega）测量，激发和发射波长分别为485 nm和530 nm。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。

2.5.5 一氧化氮分析

使用Griess试剂定量活性氮物种（RNS）的产生，该试剂通过形成一氧化氮（NO）来测量一氧化氮的水平。MC3T3-E1前成骨细胞在相同的实验条件下接种在48孔平底板中，采用间接接触方法。粘附24小时后，施加处理。在暴露的第1天、7天和14天，细胞用PBS洗涤两次，然后加入200 μL的100 μM DCFH-DA溶液。培养板在37 °C、5% CO2的湿润气氛中孵育30分钟，避光。之后移除探针溶液，并用PBS洗涤孔，然后加入100 μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Vitrocell）。荧光强度使用BioTek微孔板荧光计（Promega）测量，激发和发射波长分别为485 nm和530 nm。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。

2.5.6 细胞外基质矿化

对于矿化实验，MC3T3-E1成骨细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种在12孔板（Corning Incorporated）中。在标准培养条件下培养24小时以稳定细胞粘附后，用相应的条件培养基替换基础培养基。使用Alizarin Red S（ARS，Sigma-Aldrich；pH 4.2）染色，在孵育7天和14天后评估矿化基质的形成。在每个实验点，细胞用PBS轻轻洗涤并用4%的戊二醛（PFA，Synth）固定15分钟。用蒸馏水三次洗涤后，将孔在2%（w/v）的ARS溶液中孵育15分钟，然后进一步洗涤以去除多余的染料。为了量化步骤，将与矿物质沉积物结合的染料溶解在10%（w/v）的十六烷基吡啶inium氯化物溶液中（Synth），并搅拌1小时。使用微孔板分光光度计（BioTek Instruments，Promega）在570 nm处测量所得溶液的吸光度。作为阴性对照，仅使用基础培养基；阳性对照由成骨培养基（α-MEM，添加了10% FBS、1% β-甘油磷酸盐、1% l-抗坏血酸2-磷酸盐和0.1%地塞米松）组成。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。样品中的Ca2+和Ni2+测量使用高分辨率分子吸收光谱仪（HR-CS MAS ContrAA model 300，Analytik Jena，Jena，德国）进行。Ca2+的线性范围（LR）、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和线性调整系数（r2）分别为LR = 0.0025至0.075 mmol L?1，LOD = 0.0027 mmol L?1，LOQ = 0.009 mmol L?1，r2 = 0.998；对于Ni2+，LR = 0.0017至0.051 mmol L?1，LOD = 0.001 mmol L?1，LOQ = 0.003 mmol L?1，r2 = 0.999。

2.5.7 伤口愈合（划痕实验）

MC3T3-E1细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种在12孔板中，并孵育24小时以允许粘附。使用无菌200 μL移液器尖端在单层细胞中制造一个线性划痕，然后用PBS洗涤去除脱落的细胞。然后加入含有处理剂和1% FBS的条件培养基（1 mL），并孵育细胞长达48小时。在0小时、24小时和48小时时获取伤口区域的图像。使用ImageJ软件通过测量伤口面积随时间的减少来量化伤口闭合情况，计算公式如下：
(2)

其中A0和At分别对应0小时和t时间点的面积。所有实验都重复三次（n = 3）。

2.5.8 细胞粘附

MC3T3-E1细胞以每支架1 × 105个细胞的密度直接接种在支架表面上。在此步骤之前，支架在完整培养基中预湿4小时以达到基质的水解平衡。接种后，样品在标准培养条件下维持24小时以稳定细胞粘附。使用共聚焦激光扫描显微镜（SP8 AOBS Tandem Scanner System，Leica Microsystems）和特定的荧光标记来评估细胞形态和分布。为了准备图像，用PBS轻轻洗涤支架以去除非粘附细胞，并用4%的戊二醛（PFA；Synth）固定。使用与Alexa Fluor 488（Invitrogen）结合的phalloidin染色来可视化肌动蛋白细胞骨架，而细胞核则用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Invitrogen）进行对比。所得图像允许详细分析细胞与多孔结构上的相互作用和细胞骨架的组织。

2.5.9 抗菌实验（CFU计数法）

测试了材料对大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（S. aureus，ATCC 29213）菌株的抗菌效果。44 微生物培养至达到大约1 × 108 CFU mL?1的光学密度。在体外测试之后，将支架以0.1 g mL?1的浓度接种在Muller Hilton（MH）肉汤中，孵育24小时，温度为37 °C。作为对照，使用未接触材料的细菌悬浮液。孵育时间结束后，将试管匀浆1分钟并进行系列稀释。通过将每种稀释液的10 μL接种到含有MH琼脂的Petri皿中来量化菌落形成单位（CFUs）。培养皿在37 °C下孵育24小时。

2.5.10 细胞内ROS

细胞内ROS的生成使用荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，Sigma-Aldrich）进行评估。MC3T3-E1前成骨细胞在相同的实验条件下接种在48孔黑板中，采用间接接触方法。粘附24小时后，施加处理。在暴露的第1天、7天和14天，细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，然后加入200 μL的100 μM DCFH-DA溶液。培养板在37 °C、5% CO2的湿润气氛中孵育30分钟，避光。之后移除探针溶液，并用PBS洗涤孔，然后加入100 μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Vitrocell）。荧光强度使用BioTek微孔板荧光计（Promega）测量，激发和发射波长分别为485 nm和530 nm。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。

2.5.11 一氧化氮分析

使用Griess试剂定量活性氮物种（RNS）的产生，该试剂通过形成一氧化氮（NO）来测量一氧化氮的水平。MC3T3-E1前成骨细胞在相同的实验条件下接种在48孔平底板中，采用间接接触方法。粘附24小时后，施加处理。在暴露的第1天、7天和14天，将50 μL的培养上清液转移到新的微孔板中，然后加入50 μL新鲜制备的Griess试剂。试剂由溶液A（1%磺胺酰胺（Synth；99%）和磷酸（Sigma-Aldrich；85%）和溶液B（0.1% N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich，98%）的1:1混合物组成。混合物在室温下避光孵育15分钟。使用BioTek微孔板分光光度计（Promega）在540 nm处测量吸光度。根据修改后的Griess试剂方案（Sigma-Aldrich，G4410），根据标准亚硝酸盐溶液（nM）构建浓度曲线来计算一氧化氮浓度。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。

2.5.12 细胞外基质矿化

对于矿化实验，MC3T3-E1成骨细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种在12孔板（Corning Incorporated）中。在标准培养条件下培养24小时以稳定细胞粘附后，用相应的条件培养基替换基础培养基。使用Alizarin Red S（ARS，Sigma-Aldrich；pH 4.2）染色，在孵育7天和14天后评估矿化基质的形成。在每个实验点，细胞用PBS轻轻洗涤并用4%的戊二醛（PFA，Synth）固定15分钟。用蒸馏水三次洗涤后，将孔在2%（w/v）的ARS溶液中孵育15分钟，然后进一步洗涤以去除多余的染料。为了量化步骤，将与矿物质沉积物结合的染料溶解在10%（w/v）的十六烷基吡啶inium氯化物溶液中（Synth），并搅拌1小时。使用微孔板分光光度计（BioTek Instruments，Promega）在570 nm处测量所得溶液的吸光度。作为阴性对照，仅使用基础培养基；阳性对照由成骨培养基（α-MEM，添加了10% FBS、1% β-甘油磷酸盐、1% l-抗坏血酸2-磷酸盐和0.1%地塞米松）组成。所有实验都在三个独立实验中重复三次（n = 9）。样品中的Ca2+和Ni2+测量使用高分辨率分子吸收光谱仪（HR-CS MAS ContrAA model 300，Analytik Jena，Jena，德国）进行。Ca2+的线性范围（LR）、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和线性调整系数（r2）分别为LR = 0.0025至0.075 mmol L?1，LOD = 0.0027 mmol L?1，LOQ = 0.009 mmol L?1，r2 = 0.998；对于Ni2+，LR = 0.0017至0.051 mmol L?1，LOD = 0.001 mmol L?1，LOQ = 0.003 mmol L?1，r2 = 0.999。

2.5.13 伤口愈合（划痕实验）

MC3T3-E1细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种在12孔板中，并孵育24小时以允许粘附。使用无菌200 μL移液器尖端在单层细胞中制造一个线性划痕，然后用PBS洗涤去除脱落的细胞。然后加入含有处理剂和1% FBS的条件培养基（1 mL），并孵育细胞长达48小时。在0小时、24小时和48小时时获取伤口区域的图像。使用ImageJ软件通过测量伤口面积随时间的减少来量化伤口闭合情况，计算公式如下：
(2)

其中A0和At分别对应0小时和t时间点的面积。所有实验都重复三次（n = 3）。

2.5.14 细胞粘附

MC3T3-E1细胞以每支架1 × 105个细胞的密度直接接种在支架表面上。在此步骤之前，支架在完整培养基中预湿4小时以达到基质的水解平衡。接种后，样品在标准培养条件下维持24小时以稳定细胞粘附。使用共聚焦激光扫描显微镜（SP8 AOBS Tandem Scanner System，Leica Microsystems）和特定的荧光标记来评估细胞形态和分布。为了准备图像，用PBS轻轻洗涤支架以去除非粘附细胞，并用4%的戊二醛（PFA；Synth）固定。使用与Alexa Fluor 488（Invitrogen）结合的phalloidin染色来可视化肌动蛋白细胞骨架，而细胞核则用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Invitrogen）进行对比。所得图像允许详细分析细胞与多孔结构上的相互作用和细胞骨架的组织。

2.5.15 抗菌实验（CFU计数法）

测试了材料对大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（S. aureus，ATCC 29213）菌株的抗菌效果。44 微生物培养至达到大约1 × 108 CFU mL?1的光学密度。在体外测试之后，将支架以0.1 g mL?1的浓度接种在Muller Hilton（MH）肉汤中，孵育24小时，温度为37 °C。作为对照，使用未接触材料的细菌悬浮液。孵育时间结束后，将试管匀浆1分钟并进行系列稀释。通过将每种稀释液的10 μL接种到含有MH琼脂的Petri皿中来量化菌落形成单位（CFUs）。培养皿在37 °C下孵育24小时。最终CFU mL?1计数与对照组进行了比较，以确定抑制率。实验进行了三次独立试验（n = 3），以确保结果的可重复性。

2.5.10 统计分析

数据的统计处理使用GraphPad Prism软件（版本7.0）进行。首先，使用描述性统计和频率直方图评估数据分布，并通过Shapiro–Wilk检验验证正态性。对于参数数据，结果表示为平均值±标准差。通过单因素方差分析（ANOVA）分析实验组之间的差异，然后使用Dunnett的事后检验来确定与对照组相比的显著差异。在所有分析中，采用了<0.05的显著性水平。

3. 结果与讨论

3.1 特性分析

首先，通过XRD、FTIR和SEM研究了NiWO4纳米颗粒和羟基磷灰石的结构特性和形态特征（图S1）。NiWO4粉末的衍射图没有显示出与良好有序的单斜结构相关的典型反射峰。相反，观察到宽而强度低的峰，表明其长程晶体有序性有限。这些结果表明，本研究中获得的NiWO4可以描述为一个结构无序的系统，其中[NiO6]和[WO6]八面体单元在晶格中的排列不规则。这种行为与文献中先前报道的部分无序框架一致，导致形成了半结晶材料。相比之下，羟基磷灰石显示出明确且强度高的衍射峰，这是高度结晶材料的特征。观察到的峰对应于斜方晶系的参考模式，空间群P 63/m，证实了预期的晶体相的形成以及材料的高结构有序性。在FTIR分析中，NiWO4显示出特征性的金属-氧振动模式，与(WO4)2?单元中的W-O键和Ni-O键的伸缩有关，这与文献中报道的钨酸盐基材料一致。羟基磷灰石显示出明确的磷酸盐相关伸缩带，分别在大约1031 cm?1和989 cm?1处有吸收，分别对应于不对称和对称的P-O伸缩模式，以及在636 cm?1和557 cm?1处的O-P-O弯曲振动。获得的材料形态与先前发表的工作一致。NiWO4具有不规则的多面体形态，平均尺寸为20.8 ± 7.6，而羟基磷灰石具有纳米棒形态，平均尺寸为267.2 ± 92.6 nm。一旦分析了这些成分，就评估了它们与壳聚糖通过冷冻干燥形成支架的相互作用。图1A显示了含有不同浓度NiWO4和羟基磷灰石的支架的衍射图。纯壳聚糖（Ch样本）显示出位于16.4°和25.1°的衍射峰，对应于其半结晶无水形式。这种结构特征是由在乙酸中溶解后然后在低温下干燥的过程产生的，这促进了聚合物链在多糖基质中的部分有序排列。这种行为可以归因于将pH值调整到接近6，此时壳聚糖氨基团的部分质子化发生，减少了聚合物链之间的静电排斥，并促进了分子间相互作用，如氢键。还可以观察到一些明确的峰，与由于pH调节而形成的乙酸钠有关，这证实了Assis等人之前的研究结果。关于复合材料，可以观察到所有样本都保持了壳聚糖的初始特征。此外，在较低负载下没有观察到可归因于NiWO4或羟基磷灰石的明确衍射峰。这种行为也可以用壳聚糖支架的高度多孔结构来解释。多孔网络可能促进了纳米颗粒在聚合物基质中的部分封装，这可能进一步降低了它们的有效晶体贡献，使得检测到明显的衍射峰变得更加困难。然而，对于含有较高量NiWO4的样本，在15–40°（2θ）范围内可以看到一个宽的无定形晕圈，这可能与NiWO4的掺入复合材料有关，并可能作为其存在的间接证据。在羟基磷灰石的情况下，没有识别出明确的衍射峰，因为其主要反射与系统中存在的乙酸钠的强衍射峰重叠，掩盖了其特征信号。

支架复合材料的结构和热特性：(A) XRD图谱，(B) FTIR光谱，以及(C) DSC分析。支架的FTIR光谱显示在图1B中。壳聚糖显示出与其聚合物结构相关的特征吸收带。位于1016 cm?1的带与C–O变形振动有关。位于1545 cm?1的带归因于N–H弯曲振动，表明壳聚糖主链中存在N-乙酰化单元。位于1405 cm?1的带与聚合物链弯曲有关，具体对应于C–H弯曲振动。位于1153 cm?1的峰被归因于糖苷键（C–O–C）的不对称伸缩，而位于1047 cm?1和1016 cm?1的带与涉及C–O伸缩的骨架振动一致，这是壳聚糖的特征。在复合支架中，FTIR光谱保持了壳聚糖的特征振动，没有出现新的带或显著位移，表明无机相的掺入没有改变它们的基本化学结构，这与XRD分析一致。DSC分析不仅用于验证支架的热行为，还用于评估NiWO4和羟基磷灰石的添加如何改变壳聚糖聚合物链的流动性（图1C）。具体来说，在大约61、110和320 °C观察到了吸热峰，以及在270 °C观察到了一个放热峰。61、270和320 °C的峰与聚合物结构中无定形区域的松弛、壳聚糖的解聚和壳聚糖主链的降解有关，并且不会因添加无机填料而改变。然而，大约110 °C的峰与脱水过程或残留水分子的释放有关，在掺入NiWO4后，该峰的温度降低到了92 °C。这种位移可能归因于无机相的存在引起的聚合物网络的改变。纳米颗粒的掺入可以改变基质内的分子间相互作用，修改热分布，并影响聚合物链的流动性，从而降低释放水所需的能量。Ghaziof等人也报告了类似的行为，他们观察到在掺入Au纳米颗粒后聚合物纳米复合材料的脱水温度降低。在那项研究中，纳米颗粒起到了增塑剂的作用，使聚合物的自由体积和段状流动性提高。这导致了更低的脱水温度。这些结果支持了无机纳米颗粒可以通过改变复合材料的微观结构和分子间相互作用来影响其热行为的假设。通过SEM研究了支架的形态，如图2所示。对于通过冷冻干燥获得的壳聚糖，观察到了具有大孔的层状宏观结构的形成。获得的平均孔径为0.065 ± 0.004 mm，层片厚度为0.072 ± 0.008 mm。这种形态与Zhang等人的工作一致，他们通过冷冻干燥获得了壳聚糖支架。在添加无机填料后，可以观察到一些变化。随着羟基磷灰石的添加，层片变得更加有序，孔径的平均大小为0.052 ± 0.005 mm，层片厚度为0.167 ± 0.047 mm。在添加NiWO4（无论是否添加羟基磷灰石）后，更有组织的层状结构开始崩溃，形成了具有层片间连接的较大孔。对于Ch2.5NiW、Ch5NiW和Ch10NiW样本，获得的孔径分别为0.062 ± 0.006 mm、0.071 ± 0.004 mm和0.079 ± 0.005 mm，而层片厚度分别为0.100 ± 0.124 mm、0.132 ± 0.011 mm和0.209 ± 0.026 mm。对于ChHA2.5NiW、ChHA5NiW和ChHA10NiW样本，获得的孔径分别为0.078 ± 0.008 mm、0.098 ± 0.009 mm和0.039 ± 0.005 mm，而层片厚度分别为0.148 ± 0.013 mm、0.182 ± 0.012 mm和0.185 ± 0.008 mm。这一因素可能直接与水分子与复合材料的相互作用有关，由于添加了无机填料，这种相互作用发生了改变，这一点通过DSC结果得到了证实。Navas等人使用冷冻干燥方法制造了含有聚乙烯醇（PVA）和SiO2纳米颗粒的壳聚糖支架，并观察到了类似的行为，将这种结构的改变与PVA的羟基团和壳聚糖的初级氨基团与SiO2表面的强氢键相互作用联系起来，改善了孔的分布、大小和数量。具有明确、相互连接的孔和层状结构的支架的形态有助于营养物和代谢物的运输、氧气扩散、细胞粘附、增殖和迁移，这对于适当的生物性能至关重要。

图2

通过SEM对支架的形态学分析：(A) Ch，(B) Ch2.5NiW，(C) Ch5NiW，(D) Ch10NiW，(E) ChHA，(F) ChHA2.5NiW，(G) ChHA5NiW，(H) ChHA10NiW。孔隙率结果（图S2）显示，支架的组成直接影响其结构架构。纯壳聚糖样本的孔隙率为中等（约40%），这是冷冻干燥结构的典型特征。这一结果与SEM观察结果一致，SEM显示在冰晶生长和升华过程中形成了具有相对较大孔的层状宏观结构。羟基磷灰石的掺入导致孔隙率显著降低（约15%），这可以归因于基质的更大堆积和无机相可能部分填充了孔隙，从而形成了更密集和更有组织的结构。这种行为与SEM图像一致，其中羟基磷灰石的添加导致了更有组织的层状排列和更小的孔径，表明支架的结构组织更加紧凑。另一方面，NiWO4的添加在所有样本中都促进了孔隙率的逐渐增加，在最高浓度时达到了超过55%的值。这种孔隙率的增加与SEM观察到的形态变化一致，其中层状组织变得不那么明显，形成了更大的相互连接的孔。这种行为与冷冻过程中孔隙形成过程的改变有关，因为半导体的存在可以改变分子间相互作用和冰晶形成的动态，导致更大的孔和相互连接的层片，这也通过SEM图像测量的孔径增加得到了证实。在较高的NiWO4含量下，这种效应更加明显，层片的结构重组导致了更加开放和相互连接的多孔网络。Santos等人通过向壳聚糖支架中添加葡萄籽油（GSO）展示了这种行为，其中支架的孔隙率增加了约17%，在较高浓度的样本中这种增加更为明显。

如前所述，使用XRD或FTIR无法检测到无机填料的添加，其初始效应在DSC和SEM分析中观察到。图3显示了支架的EDS映射，以确认NiWO4和羟基磷灰石的添加，而表S1展示了从EDS分析获得的半定量元素组成。对于Ch样本，观察到支架主要由C、O和少量N组成，这与聚合物组成相符。对于ChHA样本，观察到了Ca和P的出现，这是羟基磷灰石的基本元素。对于ChNiW样本，在所有浓度下都可以看到Ni和W。由于W的原子量较大以及使用的加速电压（15 kV）不足以最佳激发Ni的Kα线（7.47 keV），W更为明显。对于所有浓度的ChHANiW样本，可以观察到来自壳聚糖的C、O和N，来自羟基磷灰石的Ca和P，以及来自NiWO4的Ni和W。此外，表S1展示了从EDS分析获得的元素组成（按重量百分比），这些值与支架制备过程中使用的名义组成一致。通过EDS测定的金属含量与XRF分析得到的值相当（表S2）。这一分析表明所有组分的掺入都成功实现了。图3

支架的EDS映射：(A) Ch，(B) Ch2.5NiW，(C) Ch5NiW，(D) Ch10NiW，(E) ChHA，(F) ChHA2.5NiW，(G) ChHA5NiW，以及(H) ChHA10NiW。支架的稳定性对于维持其支撑功能和生物活性至关重要。因此，分析了它们在溶液中的稳定性，时间跨度为14天，同时观察了介质pH值的变化（图4）。水吸收受到可访问孔隙率（连通性/孔径分布）和固相亲水性的共同影响。所有材料在最初两天内都表现出较高的水吸收率，这表明溶液迅速渗透到了多孔结构中，这对于基于壳聚糖的支架来说是预期的行为，因为它们具有较高的孔隙连通性。纯壳聚糖支架的吸收值较低，这与它们的中等孔隙率（约40%）和通过SEM观察到的相对有序的层状形态一致。尽管总体孔隙率降低了，但羟基磷灰石的掺入显著增加了水吸收率，这可以归因于其亲水性以及聚合物-陶瓷界面的形成，后者增强了毛细驱动的水分保持能力。尽管羟基磷灰石通过部分占据孔隙空间降低了总孔隙率，但它增加了支架对水介质的亲和力，从而促进了结构内的水分保持。随着时间的推移，吸收值下降并趋于稳定，表明材料在初始膨胀后保持了结构完整性，没有发生网络崩塌。这一行为也与SEM观察结果一致，即含HA的支架具有更有序的层状结构和更小的孔径，这有助于膨胀过程中的结构稳定性。图4

在37°C下，支架在SBF（生理缓冲液）中的行为，时间跨度为14天：(A) 质量变化和(B) pH变化。结果以平均值±标准差表示（n = 10）。含有NiWO4的支架表现出强烈的浓度依赖性行为。在低NiWO4含量下，观察到中等且稳定的水吸收曲线，这与SEM观察到的中等孔隙率增加和层状结构的保持一致。相比之下，较高的NiWO4浓度（Ch5NiW和Ch10NiW）在最初几天内导致极高的水吸收率，随后随时间出现明显波动，表明初始尺寸不稳定性。这种行为与SEM图像中识别的孔隙率增加和层状结构的部分破坏相关，这导致了一个更开放和异质的孔隙网络，从而促进了溶液的快速渗透，但也可能在膨胀后促进局部结构重排。值得注意的是，同时含有羟基磷灰石和NiWO4的支架随时间表现出更稳定的吸收曲线，特别是在中等浓度下。在这些系统中，ChHA2.5NiW支架表现出最平衡的行为，结合了相对较高的水吸收率和在整个评估期间最小的波动。这种行为表明羟基磷灰石部分稳定了多孔结构，而NiWO4则有助于增加可访问的孔隙体积，从而在保持形态完整性的同时有利于溶液的渗透。形态分析进一步支持了这一解释，因为ChHA2.5NiW具有定义明确且相互连接的孔隙、更连续的层状结构以及较少的崩塌区域或颗粒聚集。Correia等人65在含有壳聚糖和生物活性玻璃纳米颗粒（BG-NPs）的复合系统中也观察到了这种行为，其膨胀结果表明与纯壳聚糖相比具有更大的溶剂吸收能力。这种行为归因于BG纳米颗粒部分的亲水性，它增强了材料与溶剂的相互作用。支架在SBF中浸泡1天、7天和14天后的质量变化（图S3）是在冻干后确定的，反映了浸泡期间支架表面发生的净变化。总体而言，观察到的变化是适度的，表明在评估期间没有发生突然的降解或通过化学分离导致的广泛矿物沉积。1天后，相对较小的质量变化表明支架表面与SBF的离子环境之间的初始相互作用，可能涉及离子的吸附和表面重组的早期阶段。这些初始变化与SEM观察到的多孔结构一致，后者有利于支架表面与周围溶液之间的快速接触。第7天，一些样品的质量略有增加，特别是那些含有无机相的样品。这种行为可能与磷酸钙物种在支架表面的逐渐沉积有关，这在生物活性聚合物-无机复合材料中是常见的。此外，SEM中识别出的较高孔隙率和相互连接的层状结构有利于离子在支架内的扩散，增加了这些相互作用的有效表面积。14天后，大多数样品的质量变化略有下降或趋于稳定。这一趋势表明系统接近一个相对稳定的状态，在此状态下表面沉积和缓慢的基质重组同时发生，没有显著的结构损失。这种行为是典型的，适用于浸泡在SBF中的多孔壳聚糖基支架，在短时间内表面相互作用逐渐发生，没有剧烈的质量变化。在SBF中浸泡14天后，获得了支架结构的图像（图S4）。图像显示了多孔结构的明显变化，如部分结构崩塌和孔壁变厚，以及结构的不均匀性增加。这些观察表明基质松弛和水解降解的开始，而整体3D结构保持不变。通过监测与材料直接接触的溶液的pH变化来评估支架的化学稳定性，从而评估离子释放和可能的基质降解。总体而言，所有支架的pH值都接近中性（约7.0–7.6），表明具有良好的化学稳定性和与生理环境的兼容性，没有介质的突然降解或显著的酸化/碱化。纯壳聚糖支架在最初几天和第7天到第10天之间pH值逐渐增加，然后在实验结束时略有下降。这种行为可以归因于胺基团的质子化和去质子化过程，以及聚合物基质与周围介质之间建立的酸碱平衡。含有羟基磷灰石的支架表现出略高的pH值，这与HA的微碱性以及Ca2+离子的受控释放有关，其浓度随时间增加。尽管水吸收率较高，pH值保持稳定，表明化学稳定性。对于含有NiWO4的支架，pH值接近中性，仅有轻微的波动。最低浓度（Ch2.5NiW）表现出最稳定的pH曲线，这与较低的离子释放和无机相与聚合物基质之间的良好化学兼容性相关。在较高的NiWO4含量下，最初几天内pH值略有下降，这与离子释放的增加一致；然而，很快就达到了平衡，表明没有渐进的化学降解。最后，同时含有羟基磷灰石和NiWO4的支架随时间表现出中等且更均匀的pH值，加强了羟基磷灰石的缓冲作用。特别是ChHA2.5支架表现出最稳定的物理化学行为，支持了高水合水平，同时保持了尺寸和化学稳定性。总体而言，这些结果表明支架的稳定性在很大程度上受内部结构和网络均匀性的控制。具有更有序结构和加强的孔壁的支架，尤其是那些含有羟基磷灰石和中等NiWO4浓度的支架，可以承受长时间的水环境暴露，证实了它们适用于组织工程应用。分析Ca2+和Ni2+的水平对于分别监测基质的矿化潜力以及刺激生物活性与保持支架的毒理学安全之间的平衡至关重要。离子释放的结果显示在表1中。W6+的结果未包括在内，因为它们低于设备的检测限。观察到基于羟基磷灰石的支架的Ca2+浓度随时间逐渐降低，这通常与支架上磷灰石层的成核和生长有关。Garbo等人67在SBF中观察到含有Mg2+替代物的先进羟基磷灰石也表现出类似的行为。对于所有浓度的ChNiW样品，14天后的值均未超过0.012 mM。如表1所示，Ni2+的释放随着NiWO4含量的增加和浸泡时间的延长而增加，证实了剂量依赖性和时间依赖性行为。重要的是，释放的浓度保持在毫摩尔到亚毫摩尔范围内，表明释放曲线是受控和渐进的，而不是突然的离子爆发。这些值没有达到对标准L929成纤维细胞系有毒的水平，其中TC50值为0.1–0.4 mM。28,68对于ChHANiW支架，Ca2+的释放与ChHA支架相似，表明NiWO4不干扰磷灰石层的矿化。ChHANiW样品中2.5%和5% NiWO4的Ni2+释放行为相似，但对于10%的负载，特别是在第14天，观察到了更明显的增加，达到0.036 mM。这个值仍然低于TC50；然而，它大约是相应不含羟基磷灰石的支架的三倍，可能表明与复合微结构相关的离子释放动力学发生了变化，而不是直接的细胞毒性风险。表1

在1天、7天和14天时获得的支架的离子释放（mM）结果

样品
天数
Ca2+ (mM)
Ni2+ (mM)

ChHA
1
3.400
—
7
2.220
—
14
2.090
—

Ch2.5NiW
1
—
0.003
7
—
0.006
14
—
0.009

Ch5NiW
1
—
0.003
7
—
0.006
14
—
0.008

Ch10NiW
1
—
0.005
7
—
0.012
14
—
0.012

ChHA2.5NiW
1
3.990
0.002
7
3.070
0.007
14
3.010
0.004

ChHA5NiW
1
3.230
0.003
7
3.000
0.006
14
2.550
0.007

ChHA10NiW
1
3.810
0.010
7
3.300
0.013
14
2.510
0.036

a
对于Ca2+分析，样品在超纯水中稀释，并使用稀释因子调整浓度。在BTE中，机械支撑是基本的，因为支架必须模仿天然骨的结构完整性，确保细胞粘附的机械稳定性，并在整个再生过程中抵抗生理应力以及新矿化基质的形成。基于壳聚糖的支架的机械行为受到羟基磷灰石和NiWO4颗粒掺入引起的形态变化的强烈影响（表2）。纯壳聚糖支架呈现出更紧凑的结构，层状结构更薄，形成了更连续和均匀的基质，这有利于更高的初始刚度，反映在更高的弹性模量（E）值上。随着羟基磷灰石的添加和NiWO4含量的增加，观察到逐渐向更开放和多孔结构的过渡，层状结构更厚，这有利于支架更大的柔韧性和更大的水分保持能力，如DSC所观察到的。这种孔隙率的增加和聚合物网络的不连续性导致E显著降低。另一方面，适量分布的无机相的存在，特别是对于Ch5NiW和ChHA5NiW样品，有助于加强支架壁和结构，提高了它们在压缩载荷下的抗塌陷能力，从而增加了最大压缩应力（σu）。在较高的NiWO4含量下，颗粒的过度掺入会促进结构异质性和缺陷的形成，如聚集体和弱化的界面区域，这些缺陷作为应力集中器，降低了承载效率。综合来看，支架的机械性能源于孔隙率相关的更大适应性以及结构壁的局部增强，观察到最佳的无机相含量可以最大化压缩强度。Li等人69观察到冻干壳聚糖/羟基磷灰石支架在中等HA含量下达到了最佳的压缩性能，而过量的陶瓷加载导致模量和强度降低以及压缩下的过早致密化。相比之下，Abdian等人报告了随着陶瓷含量的增加，支架的压缩强度逐渐增加。70

表2

复合支架的机械性能。结果以平均值±标准差（n = 10）的形式呈现。

样本
弹性模量（E，kPa）
最大压缩应力（σu，kPa）

Ch
144.28 ± 47.09
464.80 ± 105.08

ChHA
19.66 ± 2.54
627.76 ± 94.60

Ch2.5NiW
21.10 ± 7.67
617.82 ± 106.89

Ch5NiW
61.45 ± 4.16
678.77 ± 238.50

Ch10NiW
17.35 ± 2.41
502.51 ± 152.81

ChHA2.5NiW
9.13 ± 4.47
593.81 ± 138.75

ChHA5NiW
24.66 ± 8.76
815.10 ± 136.32

ChHA10NiW
13.84 ± 0.93
526.71 ± 75.95

3.2 体外实验

在分析了支架的结构、形态、机械性能以及稳定性之后，进行了体外测试，以评估这些支架在骨组织工程（BTE）中的潜在用途，并试图将其生物性能与其物理化学性质相关联。通过直接和间接接触条件下的resazurin测定法评估了MC3T3-E1细胞的代谢活性。结合这些方法对于区分由细胞与支架表面的直接相互作用引起的生物效应与由材料释放到培养基中的副产物或离子引起的效应至关重要。在1天、7天和14天时分析了代谢活性的结果（图5），根据ISO 10993标准，低于70%的值被认为是有毒的。图5

使用resazurine测定MC3T3-E1细胞的代谢活性。（A）直接接触；（B）间接接触。结果以平均值±标准差（n = 9）的形式呈现。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。对于直接接触（图5A），在第一天观察到Ch和ChHANiW支架在所有浓度（2.5%、5%和10%）下MC3T3-E1细胞的代谢活性略有显著增加。其他样本与对照组相比没有显示出代谢活性的显著变化。在第七天，Ch2.5NiW、Ch5NiW和ChHANiW样本的代谢活性略有下降，接近85%，而其他样本与对照组相比没有显著变化。在第十四天，Ni浓度最高的样本（Ch10NiW和ChHA10NiW）显示出毒性，代谢活性值低于40%。Ch2.5NiW、ChHA和ChHA2.5NiW样本与对照组相比没有显示出显著的代谢活性下降，而Ch、Ch5NiW和ChHA5NiW样本的代谢活性显著下降至大约80%。

3.2. 体外实验

在分析了支架的结构、形态、机械性能以及稳定性之后，进行了体外测试，以评估这些支架在骨组织工程（BTE）中的潜在用途，并试图将其生物性能与其物理化学性质相关联。通过直接和间接接触条件下的resazurin测定法评估了MC3T3-E1细胞的代谢活性。结合这些方法对于区分由细胞与支架表面的直接相互作用引起的生物效应与由材料释放到培养基中的副产物或离子引起的效应至关重要。在1天、7天和14天时分析了代谢活性的结果（图5），根据ISO 10993标准，低于70%的值被认为是有毒的。图5

使用resazurine测定MC3T3-E1细胞的代谢活性。（A）直接接触；（B）间接接触。结果以平均值±标准差（n = 9）的形式呈现。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。对于直接接触（图5A），在第一天观察到Ch和ChHANiW支架在所有浓度（2.5%、5%和10%）下MC3T3-E1细胞的代谢活性略有显著增加。其他样本与对照组相比没有显示出代谢活性的显著变化。在第七天，Ch2.5NiW、Ch5NiW和ChHANiW样本的代谢活性略有下降，接近85%，而其他样本与对照组相比没有显著变化。在第十四天，Ni浓度最高的样本（Ch10NiW和ChHA10NiW）显示出毒性，代谢活性值低于40%。Ch2.5NiW、ChHA和ChHA2.5NiW样本与对照组相比没有显示出显著的代谢活性下降，而Ch、Ch5NiW和ChHA5NiW样本的代谢活性显著下降至大约80%。对于间接接触（图5B），在第一天观察到ChHA5NiW和ChHA10NiW样本的代谢活性略有显著下降，接近80%。在第三天，含有5%和10% NiWO4的Ch、ChNiW和ChHANiW样本的代谢活性显著下降，降至75%。在第三天，Ch2.5NiW样本的代谢活性也略有显著下降，降至90%，而ChHA和ChHA2.5NiW样本与对照组相比没有显著差异。在第十四天，Ch和ChHA样本与对照组相比没有显著差异，而所有其他样本的代谢活性略有显著下降，超过80%。这些支架的毒性也通过直接接触L929细胞进行了测试（图S5），结果显示与MC3T3-E1细胞相似。这些结果表明，间接接触，即壳聚糖的陶瓷或可溶性成分的释放，并不会对MC3T3-E1细胞造成毒性，而在直接暴露于较高浓度NiWO4的支架（Ch10NiW和ChHA10NiW）14天后，观察到了毒性。一个可能的促成因素是Ni2+离子的释放与NiWO4的半导体行为相结合，可能促进表面氧化还原反应。即使在黑暗条件下，材料表面的缺陷状态也可能与水分子和溶解氧相互作用，导致高度活跃的自由基物种的形成。这些反应性中间体可能增强周围微环境的氧化应激，从而导致观察到的代谢活性下降。通过DCFDA探针检测细胞内ROS的产生和Griess反应检测RNS的产生，分析了MC3T3-E1细胞的氧化和硝化应激（图6）。关于ROS的产生，在第一天观察到含有5-10% NiWO4的ChNiW和ChHANiW样本的ROS产生显著增加，超过对照组的200%，而其他样本的细胞内ROS增加较为可控，接近140%。这一结果表明，最初与支架的接触可能会诱导适应性氧化应激，这取决于NiWO4的浓度，可能是由于这种半导体产生了细胞外ROS。在第七天，几乎所有样本的ROS产生都得到了调节，ROS产生略有显著增加，介于120%到140%之间。在第十四天，与对照组相比没有显著变化，显示出细胞的适应性。然而，应该注意的是，尽管Ch10NiW和ChHA10NiW样本的细胞内ROS值没有显著差异，但这些值远高于其他样本，因为其他样本的细胞存活率超过80%，而这两个样本的细胞存活率低于40%。关于RNS的产生，所有样本在所有实验时间都观察到较为温和和渐进的增加，达到3到5 nM的值，而基线值接近3 nM。Lee等人观察到，NO水平在1到30 nM范围内被认为是生物积极的，能够通过可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）激活途径促进血管生成、细胞存活和增殖。这些结果支持Priya等人的研究，他们用Ni2+掺杂羟基磷灰石，改善了其血管生成性能。

图6

MC3T3-E1细胞内的ROS和RNS产生。（A）使用DCFDA探针通过荧光监测ROS产生；（B）使用Griess试剂通过吸光度监测RNS产生。结果以平均值±标准差（n = 9）的形式呈现。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。图7中的伤口愈合实验（划痕实验）用于验证支架是否能在24小时和48小时暴露后刺激MC3T3-E1细胞的迁移过程。由于壳聚糖的阳离子性质，已知它可以促进与细胞膜的静电相互作用，从而实现初始粘附以及运动所需的局部接触。羟基磷灰石可能进一步增强成骨细胞相关的反应，促进细胞的定向和迁移。细胞迁移结果显示出与NiWO4存在相关的剂量依赖性行为。虽然最低浓度（2.5% NiWO4）促进了伤口闭合的显著增加，达到大约40%，但最高浓度（10% NiWO4）产生了抑制作用。这一现象表明Ni2+可能在狭窄的治疗窗口（<0.008 mM）内产生浓度依赖性的生物效应，超过这个窗口后，代谢抑制可能会损害细胞运动。Liu等人在糖尿病伤口愈合中也报告了类似的行为，其中过度和持续时间的氧化应激会损害细胞迁移和组织再生，而受控的生物活性刺激可以恢复修复途径。低浓度的Ni2+可能调节细胞氧化还原信号通路，而不是引起明显的氧化损伤。亚毒性水平的过渡金属离子可以参与氧化还原敏感的信号级联反应，包括NF-κB、MAPK和HIF-1α通路的调节，这些通路与细胞迁移、血管生成和炎症调节密切相关。在适当的治疗窗口内，Ni2+可能有助于精细调节氧化还原微环境和炎症平衡，从而支持细胞骨架动态和定向细胞迁移。相反，过量的Ni2+会加剧代谢应激，导致线粒体功能障碍、ROS积累增加和肌动蛋白细胞骨架组织破坏，从而损害迁移能力。因此，优化Ni2+含量对于探索镍的有益生物效应同时避免抑制反应至关重要。图7

使用MC3T3-E1的复合支架的伤口愈合结果（划痕实验）。（A）暴露于支架条件培养基后0小时、24小时和48小时的细胞迁移实验图像。（B）24小时和（C）48小时的伤口闭合量化。结果以平均值±标准差（n = 3）的形式呈现。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。为了评估细胞的矿化能力，在7天和14天后使用了ARS染色实验，识别与MC3T3-E1细胞成骨分化相关的Ca沉积（图8）。重要的是要强调，通过ARS观察到的染色反映了细胞介导的矿化，而不仅仅是来自支架羟基磷灰石的Ca2+离子的物理化学沉淀。这一生物过程的特点是活性分泌基质囊泡和碱性磷酸酶的作用，促进了新合成的胶原基质上磷灰石晶体的有序成核，这是MC3T3-E1前成骨细胞功能分化的明确标志。图8A显示，除了Ch样本外，其他样本在7天后都显示出成骨分化和矿化沉积的显著增加，特别是ChHA、Ch2.5NiW和ChHA2.5NiW样本。在14天内，ChHA2.5NiW样本表现出类似的行为，显示出更强的成骨能力。这可以通过图8B中用ARS染色的钙沉积照片得到证实。这些结果与先前的研究一致，这些研究表明在羟基磷灰石中掺入Ni2+可以增加其成骨分化能力和矿化沉积。

图8

使用ARS染色实验在7天和14天后检测MC3T3-E1细胞的成骨分化。（A）样本的显微照片；（B）定量分析。结果以平均值±标准差（n = 3）的形式呈现。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。共聚焦显微镜用于研究MC3T3-E1细胞在支架上的粘附轮廓和形态（图9）。使用DAPI标记细胞核，使用Alexa Fluor 488-phalloidin标记细胞骨架。然而，注意到DAPI对支架有非特异性亲和力，直接与支架基质相互作用，而不是仅限于细胞核。相比之下，phalloidin显示出高特异性，能够清晰地可视化细胞骨架组织和细胞在材料表面的扩展。对于Ch样本，观察到密集的细胞群附着在支架表面；然而，主要是球形形态，表明细胞处于应激状态，细胞质扩展受限。在Ch2.5NiW和Ch5NiW样本中也观察到类似的现象，显示出大量的细胞但细胞丝状扩展较少。相比之下，Ch10NiW样本显示出细胞密度和亲和力的降低，细胞呈现严格的球形形态，证实了该样本的粘附能力较低。另一方面，ChHA组显示出不同的情况；除了高细胞密度外，细胞还表现出完全扩展的表型，表明羟基磷灰石的掺入是促进MC3T3-E1前成骨细胞粘附和锚定的强效诱导剂。Fu等人在聚（乳酸-羟基乙酸）酸载体中也观察到了这一现象，其中与纯聚合物相比，羟基磷灰石的添加提高了粘附能力、常规化和成骨分化。这些结果与之前的研究一致，这些研究表明在羟基磷灰石中掺入Ni2+可以增加成骨分化和矿化沉积。

图8

使用ARS染色实验在7天和14天后检测MC3T3-E1细胞的成骨分化。（A）样本的显微照片；（B）定量分析。结果以平均值±标准差（n = 3）的形式呈现。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。共聚焦显微镜用于研究MC3T3-E1细胞在支架上的粘附轮廓和形态（图9）。使用DAPI标记细胞核，使用Alexa Fluor 488-phalloidin标记细胞骨架。然而，注意到DAPI对支架有非特异性亲和力，直接与支架基质相互作用，而不是仅限于细胞核。相比之下，phalloidin显示出高特异性，能够清晰地可视化细胞骨架组织和细胞在材料表面的扩展。对于Ch样本，观察到密集的细胞群附着在支架表面；然而，主要是球形形态，表明细胞处于应激状态，细胞质扩展受限。在Ch2.5NiW和Ch5NiW样本中也观察到类似的现象，显示出大量的细胞但细胞丝状扩展较少。相比之下，Ch10NiW样本显示出细胞密度和亲和力的降低，细胞呈现严格的球形形态，证实了该样本的粘附能力较低。另一方面，ChHA组显示出不同的情况；除了高细胞密度外，细胞还表现出完全扩展的表型，表明羟基磷灰石的掺入是促进粘附和锚定的强效诱导剂。Fu等人在聚（乳酸-羟基乙酸）酸载体中也观察到了这一现象，这与纯聚合物相比有所提高，这与HA的粗糙表面和生物相容性有关，后者可以增加粘附、常规化和成骨分化。ChHA2.5NiW和ChHA5NiW样本也显示出类似的情况，与ChHA10NiW样本相反，后者再次观察到球形形态。这些结果与代谢活性和氧化应激的结果一致，表明高浓度的NiWO4对细胞发育有害。图9

共聚焦光学显微镜图像显示了接触支架1天后粘附的MC3T3-E1细胞，通过phalloidin可视化细胞骨架组织。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗微生物性能评估作为所开发支架多功能性的补充证据进行了测试，结果如表3所示。样品Ch以及样品ChHA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均没有表现出显著的抗微生物活性，微生物数量减少幅度低于30%，表明其单独使用不足以有效控制感染。另一方面，加入NiWO4后显著提高了抗微生物性能，且效果与剂量呈正相关，金黄色葡萄球菌的数量减少了80%以上，其中样品Ch10NiW的减少幅度最大（98.3%）。对于大肠杆菌，所有样品的抗微生物性能值均超过95%，其中样品Ch10NiW的减少幅度同样最大（99.3%）。这一行为表明NiWO4对于抑制细菌至关重要，可能通过破坏细菌膜和释放Ni2+及活性氧（ROS）增加细胞应激来实现，由于革兰氏阴性细菌的膜较薄，因此对其作用更为敏感。Alshemary等人观察到，掺镍羟基磷灰石（NiWO4-doped hydroxyapatite）由于Ni2+与细菌表面带电的磷酸基团和羧基团之间的相互作用，增强了其对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗微生物效果。Karthiga等人评估了NiWO4纳米颗粒的抗微生物活性，发现其对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌（Salmonella）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和黑曲霉（Aspergillus niger）均有效，这是由于Ni2+的释放和ROS的产生。

表3

复合支架的抗微生物活性。结果以平均值±标准差（n = 3）表示。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后进行事后检验，当*p < 0.05时认为差异具有统计学意义。

样品 CFU/mL 对数减少值 失活百分比
---------------------- ---------------------------- ---------------------- -------------------
金黄色葡萄球菌（S. aureus）
对照 4.24 × 10^7 ± 2.39 × 10^6 — —
Ch 2.99 × 10^7 ± 6.78 × 10^5* 0.15 29.48
Ch2.5NiW 4.22 × 10^6 ± 1.14 × 10^6* 1.00 90.05
Ch5NiW 1.23 × 10^6 ± 4.03 × 10^5* 1.54 97.10
Ch10NiW 7.25 × 10^5 ± 6.28 × 10^4* 1.77 98.29
ChHA 3.35 × 10^7 ± 2.46 × 10^5* 0.10 20.99
ChHA2.5NiW 7.33 × 10^6 ± 4.57 × 10^5* 0.76 82.71
ChHA5NiW 3.92 × 10^6 ± 1.08 × 10^5* 1.03 90.75
ChHA10NiW 9.39 × 10^5 ± 8.08 × 10^4* 1.65 97.78

大肠杆菌（E. coli）
对照 2.48 × 10^8 ± 2.95 × 10^7 — —
Ch 1.97 × 10^8 ± 2.33 × 10^6* 0.10 20.56
Ch2.5NiW 9.08 × 10^6 ± 8.07 × 10^5* 1.44 96.34
Ch5NiW 5.22 × 10^6 ± 4.03 × 10^5* 1.68 97.89
Ch10NiW 1.71 × 10^6 ± 3.22 × 10^5* 2.16 99.31
ChHA 2.31 × 10^8 ± 1.12 × 10^7* 0.03 6.85
ChHA2.5NiW 1.22 × 10^7 ± 6.21 × 10^6* 1.31 95.08
ChHA5NiW 8.38 × 10^6 ± 7.18 × 10^5* 1.47 96.62
ChHA10NiW 5.69 × 10^6 ± 2.54 × 10^5* 1.64 97.70

从表中可以看出，壳聚糖（chitosan）、羟基磷灰石（hydroxyapatite）和NiWO4之间存在协同效应（见图10）。壳聚糖作为结构基质，用于固定无机纳米颗粒；羟基磷灰石提高了生物相容性和细胞粘附性，同时不会引起显著的氧化应激。低浓度的NiWO4优化了细胞迁移性，促进了前成骨细胞（pre-osteoblasts）的骨形成分化，并赋予支架抗微生物特性。通过平衡物理化学性质和生物活性，ChHA2.5NiW样品成为生物组织工程（BTE）应用中的有希望的候选材料。

4. 结论

用于生物组织工程（BTE）的新生物材料的开发持续进行。在这方面，通过先进制造方法获得的具有特定组成的混合材料成为成功改善组织修复过程的潜在候选者。在本研究中，通过冷冻干燥制备的壳聚糖和羟基磷灰石混合支架通过添加非晶态NiWO4半导体纳米颗粒得到了增强，这些纳米颗粒能够在黑暗环境中释放Ni2+并产生ROS。结构和形态分析表明，在制造过程中这些成分没有降解，但聚合物与无机填料之间的协同作用直接影响了它们的形态，进而影响了它们的机械性能、稳定性以及Ca2+和Ni2+离子的释放。这些混合支架仅在长时间暴露下对MC3T3-E1和L929细胞表现出毒性，尤其是在NiWO4浓度最高（10%）的情况下。此外，NiWO4增加了细胞内的氧化应激，但这种应激在这些细胞经过适应过程后得到了调节。壳聚糖为支架提供了必要的结构支持，而羟基磷灰石提高了其生物相容性，并促进了细胞粘附性的改善。同时，NiWO4通过增加细胞迁移率促进了细胞运动性，并诱导了MC3T3-E1细胞的骨分化，从而增加了Ca盐的矿化，这一点通过ARS测试得到了证实。由于Ni2+和ROS的受控释放，这些支架还对革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性（大肠杆菌）细菌具有抗微生物活性，从而赋予了支架多功能性。ChHA2.5NiW样品（含10%羟基磷灰石和2.5% NiWO4）具有许多结构、形态和生物活性特性，使其成为BTE应用的理想候选材料。它是一种结合了生物活性和受控氧化还原调节的多功能支架。这些结果还表明，纳米结构半导体可能成为组织工程平台中的新型功能性添加剂，超越了它们传统的催化作用。后续研究将集中于阐明NiWO4在与细胞增殖、分化和氧化还原调节相关的细胞代谢途径中的确切功能，并开发更广泛的体内模型以确认这些材料的生物疗效和长期安全性。

作者贡献

G. A. G.：概念化、方法论设计、数据收集、形式验证、资源管理、可视化、初稿撰写及审稿编辑。D. G. N. N.、K. S. J. S. 和 M. B.：方法论设计、数据收集和形式验证。A. S. A. 和 J. P. S. P.：方法论设计、数据收集。R. N. G.、A. J. M. 和 A. C. M. R.：形式验证、资源管理、项目监督、资源管理及审稿编辑。E. L. 和 M. A.：概念化、方法论设计、数据收集、形式验证、资源管理、项目监督、资源管理、初稿撰写及审稿编辑。

利益冲突

无需要声明的利益冲突。

数据可用性

本文的数据，包括表征和生物测定数据，可在Zenodo网站上获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.18364166。补充信息（SI）也可获取：https://doi.org/10.1039/d6bm00120c。

致谢

本工作得到了圣保罗州研究基金会（Funda??o de Amparo à Pesquisa do Estado de S?o Paulo – FAPESP）的资助，项目编号为#2013/07296-2、#2024/15977-4、#2024/19218-0、#2026/00695-9、#2024/11111-2、#2025/03246-8、#2022/13515-8、#2021/11845-8和#2022/06219-3。作者还感谢巴西高等教育部人员培训协调委员会（Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES）和巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq）的财政支持。