超滤–微孔分离电泳（MSPE）结合原位季胺羟肟化反应，用于液相色谱–质谱/质谱（LC–MS/MS）法对九种游离血清雄激素的定量分析

《Journal of Chromatography B》：Ultrafiltration–MSPE with in-situ quaternary aminooxy oximation for LC–MS/MS quantification of nine serum free androgens

游离雄激素检测新方法：结合超滤、磁固相萃取及在线氧化衍生化，建立液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）多指标同步定量体系，验证显示pg/mL级灵敏度及良好回收率，应用于PCOS诊断的生物标志物研究。

　　

Xianhua Zhang|Lingling Liu|Huiyu Xu|Xin Xiong|Rongsheng Zhao|Libo Zhao|Rong Li|Li Yang

北京大学第三医院药学部，北京 100191，中国

摘要

由于循环中的雄激素浓度极低且会在人体血清中与大量蛋白质结合，因此准确量化这些雄激素（尤其是其生物活性游离部分）在分析上具有挑战性。在此，我们开发并验证了一种集成超滤–LC–MS/MS方法，用于同时定量九种内源性血清游离雄激素。游离部分通过磷酸盐缓冲盐水稀释后，使用预处理的再生纤维素膜进行温度控制的离心超滤（37°C）来分离，以减少非特异性吸附。超滤液经过磁性固相萃取（MSPE）纯化和富集，并采用季胺氧基试剂进行原位氧化衍生化处理，以提高电喷雾响应。验证数据显示该方法具有pg/mL级别的灵敏度，最低检测限（LLOQ）为0.5–10 pg/mL，线性良好（r > 0.99），基质效应可接受，回收率较高。该方法应用于86名（21–50岁）接受不孕症评估的女性患者的血清样本，结果显示，在AMH水平升高的多囊卵巢综合征（PCOS）疑似亚组中，游离睾酮、11β-羟基雄烯二酮和雄烯二酮的含量高于对照组。总体而言，这种超滤–MSPE–原位衍生化LC–MS/MS方法为临床研究中血清游离雄激素的多重测量提供了一个实用且稳健的平台。

引言

雄激素是调节生长、体成分、能量平衡和生殖功能的关键因子[1]，[2]。实际上，除了经典的雄激素外，11-氧化雄激素在肾上腺驱动的疾病和高雄激素表型（包括多囊卵巢综合征[PCOS]）中也起着重要作用[3]，[4]，[5]，[6]。然而，总雄激素浓度并不能可靠地反映其生物利用度，因为总睾酮水平相似的个体可能具有显著不同的游离部分，而临床上显著的雄激素过量可能仅表现为总激素水平的轻微变化[2]。这可以通过以下机制解释：大多数血清雄激素与性激素结合球蛋白（SHBG）和白蛋白结合循环，只有少量的未结合部分才是“游离”激素[7]，[8]。游离部分的测定受个体间结合蛋白差异的影响显著；SHBG水平受脂肪含量、胰岛素失调、甲状腺状态、激素避孕和年龄等因素的影响[5]，[9]，[10]，[11]。在这种情况下，确保结果在不同生理背景下仍具有稳健性和可解释性至关重要。

尽管如此，直接测定血清游离雄激素的方法仍然有限。目前的临床方法通常依赖于质量作用方程来估算游离睾酮[12]，[13]，但这取决于所选方程和假设，并且容易受到基础睾酮和SHBG检测方法分析变异性的影响[14]，[15]，[16]。已经提出了多种分离游离部分的策略，包括平衡透析、离心超滤、稳态凝胶过滤和示踪类似物免疫测定[7]，[17]。平衡透析耗时且受温度、透析平衡时间、稀释度、缓冲液组成和膜吸附等参数的影响，这使得该方法难以常规应用和实验室间标准化[7]，[17]。类似物免疫测定操作简便，但容易受到蛋白质结合干扰和检测特异性偏差的影响[18]，[19]。值得注意的是，离心超滤是一种实用的选择，它允许低分子量的游离类固醇通过超滤膜，而蛋白质结合成分则被留在膜上[20]，[21]，[22]。

液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）具有高特异性和多重检测能力，但其临床应用受到灵敏度和稳健性的限制[23]。实际上，女性血清中的游离雄激素（如DHT和11-酮-DHT（11KDHT）浓度可能非常低[16]，[22]，[24]。将检测范围扩展到包括经典雄激素和11-氧化雄激素会进一步增加分析复杂性。此外，超滤液并非“空白”样品；残留的基质成分仍可能影响离子抑制，从而影响长期的稳健性和重复性。因此，仍需要一种分析上和操作上可行的超滤–LC–MS/MS方法，该方法能够（i）控制分离条件以保持生理结合平衡并减少操作偏差，（ii）最小化吸附损失，（iii）有效富集和简化基质以支持在pg/mL水平上的可靠定量，（iv）具备与常规实验室工作流程兼容的分析有效性和样品前稳定性[7]，[16]，[22]。

基于我们之前关于血清游离睾酮（T）和A₄测定的研究[25]，本研究报道了一种集成超滤–LC–MS/MS方法，用于同时定量九种内源性血清游离雄激素。该方法结合了使用预处理的再生纤维素膜进行温度控制的超滤、磁性固相萃取（MSPE）进行富集和基质清除，并采用新型季胺氧基（QAO）试剂进行原位氧化衍生化处理，以提高电喷雾离子化效率。此外，该方法通过分析抗苗勒管激素（AMH）水平分层的女性样本中的游离雄激素谱型来验证其实验室实用性，包括一个高度疑似PCOS的亚组和对照组。

化学品和试剂

睾酮的参考标准品来自欧洲药典。A₄购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（上海，中国）。DHEA购自MedChemExpress（新泽西州蒙茅斯 junction）。DHT和11-KT购自CFWLABs Inc.（加利福尼亚州核桃市）。其他类固醇标准品，包括11-OHT、11-OHA₄、11-KA₄和11-KDHT，购自Steraloids Inc.（罗德岛州纽波特）。

使用稳定同位素标记的内标（IS）进行定量。11OHA₄-d₄

非特异性吸附和超滤效率的评估

为了减少再生纤维素超滤膜上的非特异性吸附，评估了五种预处理方法，相应的超滤回收率（%）总结在表S3中。仅用去离子水简单冲洗（方法1）会导致IS峰形变形和干扰信号，表明设备处理不当。用0.1 mol/L NaOH预处理（方法2）会降低大多数分析物的回收率，因此未进一步采用。

结论

在这项研究中，我们开发并验证了一种超滤–LC–MS/MS方法，用于同时定量九种内源性血清游离雄激素。游离部分通过温度控制的离心超滤分离，随后通过MSPE结合原位氧化衍生化处理以减少吸附损失并增强电喷雾响应，从而实现对低浓度游离雄激素的敏感检测。该方法考虑了实验室操作的实用性。

研究伦理

该研究获得了北京大学第三医院医学伦理委员会的批准（批准编号：IRB00006761-M2022236）。

研究资助

本研究得到了国家自然科学基金 [资助编号 82172368]和国家重点研发计划 [资助编号 2022YFC3401205 & 2023YFC2705500]的支持。

CRediT作者贡献声明

Xianhua Zhang：撰写–初稿、可视化、方法学设计、资金获取、概念构思。Lingling Liu：验证、数据分析、正式分析、数据管理。Huiyu Xu：撰写–审稿与编辑、资源获取、方法学设计、资金获取、数据管理。Xin Xiong：资源获取、方法学设计、数据分析。Rongsheng Zhao：项目监督、项目管理。Libo Zhao：资源获取、数据分析。Rong Li：项目监督、资源获取、概念构思。Li Yang：撰写–审稿与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。