《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Computational design and molecular characterization of a multi-epitope peptide vaccine targeting pancreatic cancer
编辑推荐：
本研究针对胰腺癌高致死率、传统疗法疗效有限的难题，通过免疫信息学技术设计靶向ITGA2、LAMC2、BMPR2、ZFP91、S100A16的多表位肽疫苗。经抗原性、非致敏性、稳定性及TLR4分子对接验证，结合分子动力学模拟与免疫模拟，证实该疫苗可诱导强效体液与细胞免疫应答，为胰腺癌免疫治疗提供新型候选方案。
胰腺癌被称为“癌中之王”，其恶性程度极高，全球范围内死亡率居高不下，预计不久后将跃升至癌症相关死亡的第三位。尽管医学技术不断进步，胰腺癌患者的5年生存率仍未得到显著改善，传统治疗手段面临巨大瓶颈。在这样的背景下，免疫治疗异军突起，尤其是癌症疫苗，通过激活人体自身免疫系统精准识别并清除肿瘤细胞，同时减少对正常组织的损伤，展现出持久的治疗潜力，成为攻克胰腺癌的新希望。然而，如何精准选择肿瘤相关抗原（TAA）、设计能高效激活免疫应答的疫苗结构，仍是亟待解决的关键科学问题。近期，一项发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》的研究，通过先进的免疫信息学技术，成功设计出一种靶向胰腺癌的多表位肽疫苗，为这一难题提供了创新解决方案。
该研究由Seyed Mostafa Rahimi和Hamid Reza Nouri团队完成，他们首先筛选了在胰腺肿瘤中高表达的ITGA2（整合素α2前体）、LAMC2（层粘连蛋白亚基γ2）、BMPR2（骨形态发生蛋白受体2）、ZFP91（锌指蛋白91）和S100A16这五个关键抗原，这些蛋白均参与肿瘤进展、转移和化疗耐药。研究人员利用多种生物信息学工具预测了这些抗原的主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类免疫原性表位，并通过干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）诱导能力评估、毒性分析筛选出最优表位。随后，他们将筛选出的表位通过合适的连接肽（如AAY、EAAAK等）串联，并在N端加入HIV TAT细胞穿透肽（CPP）和β-防御素2（高效佐剂），C端加入His标签以便纯化，构建了多表位疫苗候选物。为确保疫苗的有效性和安全性，研究团队进行了全面的理化性质分析、二级和三级结构预测与优化，并通过分子对接和动力学模拟验证了疫苗与TLR4（ Toll样受体4）受体的结合稳定性，还利用免疫模拟预测了其诱导免疫应答的能力，最终完成了大肠杆菌表达系统的密码子优化和体外克隆模拟。
3.1. Initial evaluations of obtained sequences
研究人员从UniProt和NCBI数据库获取了ZFP91、S100A16、BMPR2、LAMC2和ITGA2的氨基酸序列，通过生物信息学工具筛选出12个MHC I类表位和12个MHC II类表位。这些表位均具有非毒性、高免疫原性，且多数能诱导IFN-γ或IL-4产生，为后续疫苗构建奠定了基础。
3.2. MHC epitope selection
进一步确认了上述24个表位的免疫原性评分和对应的HLA等位基因，这些表位覆盖了人群中高频的HLA类型，确保了疫苗的广泛适用性。
3.3. Chimeric multi-epitope vaccine construct
将筛选出的24个MHC I类和II类表位通过连接肽串联，同时整合了TAT细胞穿透肽、β-防御素2佐剂、PADRE序列（用于诱导强效T细胞应答）和His标签，形成了完整的疫苗构建体。
3.4. Adaptation of the codon and mRNA construct of the proposed vaccine
通过JCAT工具对疫苗序列进行大肠杆菌密码子优化，优化后序列长度为1983核苷酸，GC含量52.84%，密码子适应指数（CAI）达0.967。mRNA二级结构预测显示最小自由能为-719.9 kcal/mol，且无5'端发夹或假结，有利于翻译起始。
3.5. Evaluation of antigenicity, allergenicity, physicochemical features, and solubility of the proposed construct
VaxiJen和ANTIGENPro服务器确认疫苗具有抗原性；AlgPred和AllergenFP预测其为非致敏性。理化性质分析显示，疫苗分子量73.7 kDa，理论等电点（pI）8.64，由661个氨基酸组成，平均亲水值（GRAVY）-0.413，脂肪族指数77.14，不稳定指数31.07，表明其稳定性良好。在哺乳动物网织红细胞、酵母和大肠杆菌中的估计半衰期分别大于30小时、20小时和10小时，且在大肠杆菌中过表达后溶解度概率高达0.988671。
3.6. Determination of secondary and tertiary structure of vaccine candidate
二级结构预测显示疫苗包含49.31%α-螺旋、14.52%β-折叠和36.17%无规卷曲。通过RaptorX服务器成功预测了疫苗的三级结构模型。
3.7. Refinement process and in silico validation of the 3D construct
使用GalaxyRefine对初始三维模型进行优化，优化后Z-score从-9.33提升至-9.67，处于实验测定结构的合理范围。Ramachandran图分析显示，98.4%的残基位于高度优选区域，1.6%位于优选区域，无不合理的残基构象，结构质量显著提升。
3.8. Intrinsic protein disorder prediction
DisEMBL和IUPred预测发现疫苗序列中存在多个内在无序区域，这些区域可能参与抗原呈递和抗体结合，有助于增强疫苗的免疫原性。
3.9. Prediction of B-cell epitopes
ElliPro服务器预测出多个线性和构象B细胞表位，其中线性表位最长可达78个氨基酸，构象表位涉及多个不连续区域的残基，表明疫苗能有效诱导体液免疫应答。
3.10. Disulfide bond engineering of the ultimate construct
通过DbD2服务器筛选出TYR32-ALA70和MET347-THR350两对潜在的可形成二硫键的残基，突变后可进一步增强疫苗的结构稳定性。
3.11. Study of molecular docking with TLR4, MHC-I, and MHC-II
利用HDOCK服务器将疫苗分别与TLR4（PDB ID: 4G8A）、MHC-I（PDB ID: 4U6Y）和MHC-II（PDB ID: 1AQD）进行分子对接，结果显示疫苗与这些免疫受体均能形成稳定的复合物，结合亲和力良好。
3.12. Molecular dynamics simulation
对疫苗-TLR4复合物进行100 ns的分子动力学模拟（GROMACS软件）。能量最小化后，体系温度和压力分别在300 K和0 bar稳定。回转半径（Rg）保持稳定，表明复合物结构紧凑；均方根偏差（RMSD）在0.5-1.2 nm范围内波动，显示结构稳定性；均方根涨落（RMSF）分析揭示了柔性区域。此外，iMODS服务器的正态模式分析（NMA）进一步证实了复合物的结构刚性和运动特性。
3.13. In silico replication of the vaccine
将优化后的疫苗DNA序列插入pET21b(+)表达载体，通过BamHI和NotI限制性内切酶位点进行定向克隆，构建的重组质粒总长度为7424碱基对，为后续大肠杆菌表达奠定了基础。
3.14. Immune simulation
C-ImmSim服务器模拟免疫接种过程显示，初次注射和两次加强免疫后，IgM和IgG抗体水平显著升高，且能长期维持。B细胞、辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）数量均显著增加，尤其是记忆细胞亚群。树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）和巨噬细胞等先天免疫细胞也被有效激活，同时IL-2和IFN-γ水平升高，提示疫苗可诱导强烈的体液和细胞免疫应答，并可能调节Th1/Th2平衡向Th1偏移。
3.15. Population coverage
利用IEDB工具分析显示，该疫苗的全球人群覆盖率超过99%（MHC I类99.02%，MHC II类99.66%），平均每个个体可识别6.35个MHC I类表位和6.07个MHC II类表位，具有广泛的适用性。
研究结论与讨论部分指出，胰腺癌的高致死率迫切需要新型治疗策略，多表位疫苗因其能诱导广谱免疫应答且不良反应少而成为研究热点。本研究设计的疫苗靶向ITGA2、LAMC2、BMPR2、ZFP91和S100A16，这些抗原在胰腺癌中高表达且与肿瘤进展密切相关。通过系统的免疫信息学分析和分子验证，证实该疫苗具有良好的抗原性、稳定性、溶解性和安全性，能有效结合TLR4并诱导强效的细胞和体液免疫应答，且覆盖绝大多数全球人群。尽管该研究为计算机模拟结果，仍需进一步的体外和体内实验验证其实际免疫原性和抗肿瘤效果，但其为胰腺癌的免疫治疗提供了一种极具潜力的候选疫苗设计方案，也为其他癌症的多表位疫苗研发提供了可借鉴的方法学框架。
