BF2和PO2修饰的Oxasmaragdyrins——激发态性质、单线态氧的产生以及在携带结肠肿瘤的小鼠体内的成像潜力

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：BF2- and PO2-Chealted Oxasmaragdyrins – Excited state properties, singlet oxygen generation, and imaging potential in mice bearing colon tumor

研究评估了氧基smaragdyrin（SmFb）及其BF2-和PO2-衍生物在单线态氧产生和荧光成像中的潜力，通过光谱分析和动物实验发现BF2-Sm具有显著的肿瘤特异性成像能力。

　　

Nayan Patel | Mykhaylo Dukh | Ravindra K. Pandey | Neha Tripathi | Mangalampalli Ravikanth | Youngwoo Jang | Habtom B. Gobeze | Francis D’Souza

PDT中心，细胞应激生物学，Roswell Park综合癌症中心，纽约州布法罗市14263，美国

摘要

自由基形式的oxasmaragdyrin（SmFb）是一种含有四个吡咯环和一个呋喃环的22-π电子芳香大环结构，这些环通过三个甲炔桥和两个直接键连接。其BF₂-（SmBF₂）和PO₂-（SmPO₂）衍生物在meso-芳基环上引入了极性和非极性基团。本研究评估了这些化合物产生单线态氧的能力以及在患有结肠癌的小鼠体内的荧光成像潜力。oxasmaragdyrin衍生物在可见光/近红外区域有吸收峰，荧光波长在700至750纳米之间，而磷光波长在875至1000纳米范围内。测得的荧光寿命和量子产率与四吡咯类似物相近。通过飞秒和纳秒瞬态吸收光谱研究，探讨了代表性SmBF₂和SmPO₂在甲苯中的激发态性质。SmBF₂和SmPO₂的三重态寿命分别为72纳秒和38纳秒。这两种衍生物均具有产生单线态氧的能力，其量子产率与四苯基卟啉相当。通过能量级图展示了从Sm衍生物生成单线态氧的机制。使用‘体内成像系统’（IVIS）比较了这些衍生物在患有Colon26肿瘤的小鼠中的肿瘤特异性、荧光成像能力和生物分布。这些研究表明，BF₂-Sm在肿瘤成像方面具有显著潜力。

引言

近年来，扩展卟啉因其独特的物理化学性质而在生物化学和材料科学领域得到了广泛研究[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。这类扩展卟啉能够与镧系和锕系阳离子配位[10]、[11]、[12]、[13]、[14]，可用于阴离子传感[15]，作为磁共振成像（MRI）的对比剂[16]，以及光动力疗法（PDT）中的单线态氧生成剂[17]和非线性光学（NLO）材料[18]。其中，smaragdyrin（也称为pentaphyrin(1.1.0.1.0)）自Woodward首次合成以来一直备受关注，但直到2018年Song、Kim、Osuka及其同事在酸性条件下通过S_NAr反应将1,9-二溴-5-甲苯基BODIPY与5,10-二甲基三吡咯烷反应，并经甲磺酸处理和NaBH₄还原后，才成功合成出pentaaza [22]smaragdyrin[20]。1999年还合成了核心修饰的smaragdyrins，如22-硫代和22-oxasmaragdyrins，它们分别通过将一个吡咯环替换为噻吩或呋喃。这些衍生物具有稳定性并表现出芳香性质[21]。通过与BF₂-和PO₂单元结合形成BF₂-smargdyrins（SmBF₂）和PO₂-smargdyrins（SmPO₂），化合物的稳定性和物理化学性质得到了显著提升[22]、[23]。这些化合物在400–800纳米范围内具有吸收和发射特性，荧光量子产率和寿命良好，还可以进一步修饰以携带有用的功能基团，适用于能量收集应用[24]、[25]。在本研究中，我们进一步探讨了SmBF₂和SmPO₂衍生物的肿瘤特异性、荧光成像潜力、产生单线态氧的能力以及成像/PDT应用。所选的SmBF₂和SmPO₂衍生物的合成方法参照了相关文献[22]、[23]，其结构见图1。通过详细的光谱和光化学研究揭示了它们的激发态性质和单线态氧生成机制。最终，这些衍生物被应用于成像和PDT实验。

方法

扩展卟啉由于其新颖的物理化学性质，在近年来被广泛应用于生物化学和材料科学领域[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。这类卟啉能够与镧系和锕系阳离子配位，用于阴离子络合[10]、[11]、[12]、[14]，作为磁共振成像（MRI）的对比剂[16]，在光动力疗法（PDT）中生成单线态氧[17]，以及作为非线性光学（NLO）材料[18]。其中，smaragdyrin（也称为pentaphyrin(1.1.0.1.0)）自Woodward首次合成以来备受关注，但直到2018年Song、Kim、Osuka等人通过酸催化条件下的S_NAr反应才成功合成出pentaaza [22]smaragdyrin[20]。1999年还合成了22-硫代和22-oxasmaragdyrins，它们分别通过将一个吡咯环替换为噻吩和呋喃。这些衍生物具有稳定性并表现出芳香性质[21]。通过与BF₂-和PO₂单元结合，meso-三芳基22-oxasmaragdyrins（见图1）在化合物稳定性和物理化学性质方面得到了显著改进[22]、[23]。这些化合物在400–800纳米范围内具有吸收和发射特性，荧光量子产率和寿命良好，还可以进一步修饰以携带有用的功能基团，适用于能量收集应用[24]、[25]。在本研究中，我们进一步探讨了SmBF₂和SmPO₂衍生物的肿瘤特异性、荧光成像潜力、产生单线态氧的能力以及成像/PDT应用。所选的SmBF₂和SmPO₂衍生物的合成方法参照了相关文献[22]、[23]，其结构见图1。详细的光谱和光化学研究揭示了它们的激发态性质和单线态氧生成机制。最终，这些衍生物被应用于成像和PDT实验。

所有用于合成的化学品均从Sigma-Aldrich、Spectrochem和BLD-Pharma等商业供应商处购买。反应中使用的溶剂为ACS级，购自Fischer Scientific，并使用市售的溶剂纯化系统进行干燥。化合物的合成、表征和纯化过程详见其他文献[22]、[23]、[26]、[27]。

紫外-可见光谱测量使用Shimadzu 2550双单色仪进行。荧光和荧光寿命的测量采用Horiba Yvon Nanolog仪器，配合时间相关单光子计数器，激发光源为纳米LED。采用直角检测方法。测得的量子产率实验误差为±10%。

飞秒瞬态吸收光谱实验使用Coherent公司的Ultrafast Femtosecond Laser Source（Libra）进行，该激光器包含二极管泵浦的锁模Ti: Sapphire激光器（Vitesse）和二极管泵浦的腔内倍频Nd: YLF激光器（Evolution），产生1.50 W、脉冲宽度为100 fs的压缩激光输出。光学检测使用Light Conversion公司的Helios瞬态吸收光谱仪和光学参量放大器（OPA）。泵浦和探测脉冲的频率为1 kHz。激光器基波输出的95%被引入OPA，OPA能够产生400–2100 nm范围内的选定波长，其余输出用于生成白光连续谱。实验中，化合物在Soret带的最大吸收波长处被激发。通过时间分辨光谱数据组装出相应波长的动力学曲线，并使用全局分析方法进行分析。所有测量均在298 K的脱气溶液中进行，实验误差为±5%。

纳秒瞬态吸收测量使用Opolette HE 355 LD激光器进行，该激光器由高能Nd: YAG激光器泵浦，产生第二和第三谐波（调谐范围410–2200 nm，脉冲重复率20 Hz，脉冲长度7 ns）。光谱测量使用Proteus UV–vis–NIR闪光光解光谱仪（Ultrafast Systems，佛罗里达州萨拉索塔），探测光为光纤传输的白光，探测器为快速响应的Si光电二极管（覆盖200–1000 nm范围）或InGaAs光电二极管（覆盖900–1600 nm范围）。光电二极管和光电倍增管的输出信号由Tektronix示波器记录。数据分析使用Ultrafast Systems的Surface Xplorer软件进行，实验误差为±5%。

与大多数基于卟啉的化合物类似，smaragdyrins也不溶于水。因此，我们实验室采用了两种方法制备疏水化合物[44]：首先将1% Tween 80溶解在5%葡萄糖水溶液（D5W）中，但这类化合物在该生物相容性配方中的溶解度有限。随后发现Pluronic F127与这些化合物兼容，因此所有化合物均采用Pluronic配方进行研究。储备溶液中含有2% F127，溶解在1× DPBS中。化合物的浓度通过Beer-Lambert定律计算得出。

小鼠结肠26癌细胞在无菌的RPMI-1640培养基中培养，培养基含有1× L-谷氨酰胺，添加10%胎牛血清（FCS，Atlanta Biologicals，过滤孔径0.1 μm）和1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（P/S/l-G：10,000 IU/ml青霉素，10,000 μg/ml链霉素，29.2 mg/ml L-谷氨酰胺），并在37°C、5% CO₂氛围下的湿润培养箱中维持。

本研究使用的所有动物均为来自Fredrick国家实验室（弗雷德里克，马里兰州）的BALB/cAnNCr小鼠。8至12周龄的小鼠右肩皮下注射1×10⁶个结肠26细胞（去除相应部位的毛发）。当肿瘤生长到约4 mm×4 mm的可测量尺寸时，通过静脉注射化合物，并定期进行成像。

‘体内’实验遵循Roswell Park综合癌症中心（布法罗）的动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案进行。使用IVIS Spectrum（Perkin-Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和荧光显微镜技术，研究了oxasmaragdyrin衍生物在携带Colon26肿瘤的BALB-c小鼠中的肿瘤特异性和药代动力学特征。

所有化合物均在最佳滤光片组合下进行分析。数据选择的是信号最强且背景最少的滤光片组合。每次实验中，每只小鼠静脉注射3剂量的化合物，使每种化合物的最终浓度达到1.0 μmol/kg，然后在注射后1、2、4、6、8、12、24、48、72和96小时分别进行成像。图像分析时，围绕肿瘤定义感兴趣区域（ROIs），并记录荧光强度（平均辐射效率（(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)）。每组3只小鼠的肿瘤数据输入Microsoft Excel并绘制图表，误差条表示标准偏差。

结果与讨论

代表性SmBF₂和SmPO₂的吸收光谱见图2a，光谱性质总结见表1。所有研究的Sm衍生物在400–500 nm范围内显示出Soret型吸收峰，并在可见光区域有三个峰。重要的是，700–710 nm区域的远红峰是最强的可见光峰，这一特征常见于氯啉和细菌绿素衍生物。

结论

通过改进的合成方法获得的新合成改性Sm衍生物具有光活性，在近红外区域表现出吸收和发射（荧光和磷光）特性。这一新性质促使研究人员进一步探讨了它们的肿瘤特异性和成像潜力，结果表明它们不仅是备受追捧的单线态氧生成剂，也是癌症成像应用的理想候选物。

CRediT作者贡献声明

Nayan Patel：方法学。Mykhaylo Dukh：方法学。Ravindra K. Pandey：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，监督，方法学，研究，资金获取，概念化。Neha Tripathi：方法学。Mangalampalli Ravikanth：写作 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。Youngwoo Jang：方法学。Habtom B. Gobeze：方法学。Francis D’Souza：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，监督，软件。

未引用参考文献

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利益冲突声明

所有作者对提交的文章内容均无财务利益关系。

致谢

作者感谢NIH（项目2：Pandey）、NSF（编号2345836、2514911）以及Welch基金会（对F. D’Souza的资助）。同时感谢Roswell Park综合癌症中心和北德克萨斯大学为学生会议提供的部分资源支持。