一种源自萘酰亚胺的近红外荧光探针，可用于识别内质网中的半胱氨酸

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：A near-infrared fluorescent probe derived from naphthalimide for recognizing cysteine within the endoplasmic reticulum

近红外荧光探针用于内质网中半胱氨酸检测，通过dicyanoisophorone-naphthalimide荧光基团与丙烯酸配体设计，形成ICT增强机制，检测限102nM，在活细胞、zebrafish和mice中验证有效性。

　　

Ruxue Xia | Junhong Xu | Yijie Ma | Jing Zhou | Congjie Pan | Baiyan Wang | Qiujuan Ma

河南中医药大学药学院，郑州 450046，中国

摘要

半胱氨酸（Cys）是内质网中常见的内源性还原性巯基化合物，在生理和病理过程中发挥着关键作用。半胱氨酸水平异常升高或降低都与多种病理生理紊乱有关。因此，检测内质网中的半胱氨酸非常重要。然而，关于用于检测内质网中半胱氨酸的近红外荧光探针的研究非常少。本文开发了一种近红外（NIR）荧光探针，用于识别内质网中的半胱氨酸。选择二氰异佛尔酮-萘酰亚胺衍生物作为NIR荧光团，并使用丙烯酸基团作为半胱氨酸的传感单元。在没有半胱氨酸的情况下，由于分子内电荷转移（ICT）过程的抑制，该探针仅发出微弱的荧光。加入半胱氨酸后，由于ICT过程的发生，探针在690 nm处显示出明显的荧光。探针的荧光强度与半胱氨酸浓度在0.4至80 μM范围内呈线性相关，检测限为102 nM。该探针响应速度快、灵敏度高、选择性优异且Strokes位移较大，同时具有较低的细胞毒性，并已成功应用于内质网中半胱氨酸的检测。此外，该探针还用于斑马鱼和小鼠模型中半胱氨酸的检测。

引言

内质网（ER）作为关键的真核细胞器，在多种细胞过程中起着重要作用，包括蛋白质合成、折叠、修饰、脂质代谢和钙离子储存[1]、[2]、[3]。内质网应激由细胞内稳态失衡引起，可能由内部环境的生理波动和病理组织损伤等因素引发。内质网应激与多种疾病密切相关，如2型糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和癌症[4]、[5]、[6]、[7]。半胱氨酸（Cys）是一种常见的内源性还原性巯基化合物，在内质网应激下可通过捕获活性氧（ROS）来调节内质网的氧化还原平衡[8]、[9]。然而，过量的半胱氨酸会对生物系统产生毒性，这种毒性主要源于同型半胱氨酸的异常生成、酸碱平衡的破坏以及氧化应激的诱导[10]、[11]、[12]、[13]。因此，确定内质网中的半胱氨酸浓度对于理解其生理功能至关重要。

传统的半胱氨酸检测方法包括电化学分析[14]、质谱（MS）[15]、紫外-可见光谱（UV–Vis）[16]、[17]和高性能液相色谱（HPLC）[18]、[19]。这些方法通常成本较高、操作复杂、处理时间较长，并且不适用于体内检测。相比之下，荧光光谱具有低成本、操作简便和实时成像性能优异等优点，已被用于半胱氨酸的检测[20]、[21]、[22]。近红外（NIR）荧光探针相比传统方法具有更多优势，如更深的组织穿透能力、更低的自发荧光和组织散射、以及更高的对比度和空间分辨率[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。迄今为止，已有一些NIR荧光探针被开发用于溶酶体[31]、[32]、[33]、[34]和线粒体[35]、[36]、[37]、[38]中半胱氨酸的检测。然而，关于用于内质网中半胱氨酸检测的NIR荧光探针的研究仍然较少[39]。因此，仍有必要开发针对内质网的NIR荧光探针来检测半胱氨酸。

本文构建了一种新的NIR荧光探针，用于识别内质网中的半胱氨酸。选择二氰异佛尔酮-萘酰亚胺衍生物作为NIR荧光团，丙烯酸基团作为半胱氨酸传感单元。在加入半胱氨酸之前，该探针在690 nm处几乎不发光；而加入半胱氨酸后，在该波长处发出强烈的红色荧光。该探针具有优异的灵敏度、显著的选择性、快速的响应时间和较大的Strokes位移。此外，该探针具有良好的生物相容性，可用于活细胞内质网中外源性和内源性半胱氨酸的可视化检测。此外，该探针还应用于斑马鱼和小鼠模型中半胱氨酸的检测。

实验部分

实验

完整的实验细节，包括材料、仪器、合成方法、细胞毒性检测以及活细胞和斑马鱼的共聚焦成像方案，详见补充材料。近红外荧光探针1的设计和制备过程如图1所示。利用文献方法[40]制备的化合物2，成功制备了探针1。探针1的结构如下：

荧光探针1与半胱氨酸相互作用时的光谱特性

首先通过荧光光谱法（图1）评估了探针1与半胱氨酸的相互作用。如图1所示，在加入半胱氨酸之前，探针在540 nm激发下几乎没有荧光。加入半胱氨酸后，观察到强烈的红色荧光。随着半胱氨酸浓度的增加，荧光强度增强，在80 μM半胱氨酸浓度时达到最大值，比空白组增强了约75倍。

结论

成功开发了一种基于萘酰亚胺的近红外荧光探针，能够特异性地检测内质网中的半胱氨酸。加入半胱氨酸后，在690 nm处出现强烈的荧光，而未加入半胱氨酸时信号微弱。探针1具有高选择性、优异的灵敏度、快速的响应时间、宽的操作pH范围和较大的Strokes位移。此外，它不仅可用于半胱氨酸的可视化检测

CRediT作者贡献声明

Ruxue Xia：撰写——原始稿件，实验研究。Junhong Xu：实验研究，数据分析。Yijie Ma：实验研究，数据管理。Jing Zhou：实验研究。Congjie Pan：实验研究，资金获取。Baiyan Wang：实验研究，方法学设计。Qiujuan Ma：撰写——审稿与编辑，实验研究，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究的资金支持来自河南省关键科技项目（项目编号252102321126）、国家自然科学基金（项目编号21807027）以及河南中医药大学的仲景学者研究基金。