《Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis》：The active compound quercetin from Polygonum cuspidatum targets COL3A1 to enhance CD8? T cell cytotoxicity in gastric cancer
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胃癌免疫治疗机制研究：槲皮素靶向COL3A1抑制NF-κB/PD-L1轴逆转T细胞耗竭
云海伟|国焕晨|胡文静|肖一石|张金玉|曹景瑞|沈楚|吴中新|尹磊|高宇海
中国浙江省湖州市湖州中心医院胃肠外科，湖州大学附属中心医院，浙江中医药大学第五临床医学院，邮编313000
摘要
背景
胃癌（GC）是一种全球范围内高发的胃肠道恶性肿瘤，预后较差，其发生和发展与肿瘤免疫逃逸密切相关。
Polygonum cuspidatum（尖叶蓼）是一种传统中药，具有一定的抗肿瘤活性。然而，其关键活性成分及其调节胃癌免疫微环境的分子机制尚未得到系统阐释。
方法
基于TCGA和TCMSP数据库进行生物信息学分析，以筛选
Polygonum cuspidatum中的活性成分槲皮素的潜在靶点。通过分子对接、细胞热位移测定（CETSA）和药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）实验验证槲皮素与关键靶蛋白之间的直接相互作用。利用CCK-8、细胞增殖实验、伤口愈合实验、Transwell实验和流式细胞术评估槲皮素及COL3A1表达对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。建立了胃癌细胞与CD8? T细胞的共培养系统，并通过流式细胞术、ELISA和LDH测定评估CD8? T细胞的耗竭程度和细胞毒性功能。最后构建了小鼠异种移植肿瘤模型，以验证槲皮素的体内抗肿瘤效果。
结果
COL3A1被确定为槲皮素在胃癌中的核心靶基因，在胃癌细胞中高表达。槲皮素可直接结合COL3A1，显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。机制上，COL3A1通过激活NF-κB信号通路上调PD-L1表达，从而削弱CD8? T细胞的抗肿瘤功能。槲皮素可逆转COL3A1介导的NF-κB激活和PD-L1上调，恢复CD8? T细胞对胃癌细胞的细胞毒性。
结论
本研究揭示了槲皮素直接靶向COL3A1并抑制COL3A1/NF-κB/PD-L1轴的分子机制，从而缓解CD8? T细胞耗竭并增强胃癌的免疫抑制作用。这些发现为
Polygonum cuspidatum和槲皮素在胃癌免疫治疗中的应用提供了理论基础，并提示COL3A1可能成为潜在的治疗靶点。
引言
胃癌（GC）是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因，占所有癌症死亡的7.7%，5年总体生存率仅为32.4%[1][2]。为提高胃癌患者的生存率，一些高发国家已实施了胃癌筛查计划。但由于筛查力度有限且胃癌早期临床特征不明显，大多数患者是在晚期才被诊断出来[3][4]。化疗和放疗是晚期胃癌的一线治疗手段，但耐药性问题仍然存在[5]。尽管免疫疗法彻底改变了实体瘤的治疗方式，但对胃癌的治疗效果仍有限。肿瘤微环境（TME）的异质性促进了免疫逃逸，加剧了胃癌对传统疗法和免疫疗法的耐药性[6]。因此，创新辅助或替代疗法至关重要。几个世纪以来，传统中药已被证明在癌症的不同阶段具有治疗效果，使用中药控制癌症进展不仅可以减缓化疗耐药性的产生，还能减少化疗的副作用[7]。许多有效的中药成分来自天然植物，研究植物中的抗癌活性成分有助于减轻胃癌患者的不良症状。
Polygonum cuspidatum作为收录在《中华人民共和国药典》中的常见中药，主要分布在中国西北、东部、中部、南部和西南地区，其根茎和根为常用药用部位[8]。该植物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和神经保护作用[9][10][11][12][13]。近年来，相关研究进一步拓展了
Polygonum cuspidatum的药用价值。Lin等[14]和Feng等[15]指出
Polygonum cuspidatum对恶性肿瘤的增殖具有抑制作用。众所周知，一种草药可能含有多种活性成分，每种成分可能具有不同的药理作用。槲皮素是
Polygonum cuspidatum的主要活性成分之一[8]，也是日常饮食中常见的黄酮醇[16]。研究表明，槲皮素可抑制多种癌症（包括肺癌、胃癌、乳腺癌等）的恶性进展[17][18][19][20]。鉴于槲皮素的抗癌作用，其具体调控机制引起了众多学者的关注。例如，Zhou等[21]发现槲皮素可结合SIRT5，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而促进非小细胞肺癌的凋亡。在胃癌中，槲皮素的结合靶点及其作用机制仍需进一步研究，以改善胃癌的不良预后。
III型胶原α1（COL3A1）是一种纤维状胶原蛋白，属于结构蛋白，常见于皮肤、肺和血管等可扩张组织中，约占人体总胶原含量的5-20%[22]。包括COL3A1在内的胶原蛋白家族与癌症发生有关[23]。COL3A1在胃癌、肺癌和胶质瘤等恶性肿瘤中高表达，促进癌症进展[24][25][26]。随着对COL3A1的进一步研究，一些学者提出COL3A1的表达会影响患者的肿瘤免疫反应[27]。例如，Yang等[28]发现沉默COL3A1可抑制乳腺癌细胞中PD-L1的表达，从而抑制癌细胞的免疫逃逸能力和恶性行为。Shen等[27]认为COL3A1是评估头颈部癌症微环境中免疫细胞浸润、免疫活性和免疫检查点表达的潜在生物标志物。总体而言，COL3A1有望成为改善癌症不良预后的有效靶点。COL3A1的表达受多种因素调控，例如VanEspen等[29]发现RNF185可调节前列腺癌（PCa）中COL3A1的表达，进而影响癌细胞的恶性特性。此外，相关lncRNA、microRNA和中药提取物也是影响COL3A1表达的关键因素[30][31][32][33]。目前尚无关于Polygonum cuspidatum成分是否能够调节COL3A1表达从而介导肿瘤恶性进展的详细报道。
实验结果表明，Polygonum cuspidatum中的活性成分槲皮素增强了CD8? T细胞的细胞毒性，抑制了胃癌细胞的恶性进展。其调控机制是通过下调COL3A1的表达来抑制NF-κB信号通路的激活。总体而言，研究结果表明Polygonum cuspidatum中的活性成分槲皮素是抑制胃癌恶性进展的有效成分，表明其在胃癌免疫治疗中具有一定的潜力。
细胞培养
本研究使用的胃癌细胞系包括AGS（目录号：BNCC338141）、HGC-27（目录号：BNCC338546）和MKN-45（目录号：BNCC337682）。AGS在F-12K完全培养基中培养，而HGC-27和MKN-45则在RPMI-1640完全培养基中培养。细胞和培养基均购自BeNa Culture Collection（BNCC，中国）。正常胃上皮细胞及培养基也购自BNCC（中国），细胞系为GES-1。
Polygonum cuspidatum的活性成分槲皮素与胃癌的关系
Polygonum cuspidatum是一种常见的中药，对多种癌症的恶性进展具有影响[34]。本研究通过生物信息学分析探讨了Polygonum cuspidatum与胃癌之间的关联。基于TCGA-STAD数据库，我们发现胃癌样本中有2495个上调的DEGs（表S1和表S2）。利用TCMSP数据库，我们确定了Polygonum cuspidatum中171个有效成分的靶基因（表S2）。
讨论
研究表明，Polygonum cuspidatum中的活性成分槲皮素能有效抑制胃癌的恶性发展。随着槲皮素浓度的增加，胃癌细胞的存活率降低。经槲皮素处理后，胃癌细胞的迁移、增殖和侵袭能力减弱，凋亡率升高。通过细胞实验结合生物信息学分析，我们发现槲皮素与COL3A1结合。
伦理批准和参与同意
本研究获得了中国杭州浙江罗西医疗科技有限公司伦理委员会的批准（批准编号：LX4825010303）。
资助
本研究得到了国家中医药管理局-浙江省中医药管理局联合科技计划重点研究项目（GZY-ZJ-KJ-23094）的支持。
作者声明
不适用。
CRediT作者贡献声明
尹磊：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源提供、项目管理、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。
高宇海：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、监督、资源提供、项目管理、实验设计、数据分析、概念构建。
吴中新：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、项目管理。
利益冲突声明
作者们声明没有利益冲突。
