《Biomolecules》：Predominance of Biliverdin over Bilirubin in Human Seminal Plasma
Nina Hojnik,
Paola Sist,
Sabina Passamonti,
Borut Kova?i? and
Federica Tramer
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男性不育诊断多依赖常规精液参数，难以揭示氧化应激机制。本研究首次采用HUG荧光蛋白探针，对42例人类精浆中BV和BR进行同步定量，发现BV浓度显著高于BR，总BR与精子总数正相关，提示胆汁色素可反映男性生殖道局部氧化还原状态，为新型生化标志物开发提供依据。
随着环境压力增加，全球男性不育率持续上升，氧化应激成为核心诱因——活性氧破坏精子膜脂、DNA与蛋白，影响受精能力与子代健康。然而，临床仍以WHO指南的常规精液参数（浓度、活力、形态）为主，缺乏反映局部氧化还原状态的敏感标志物。精浆作为睾酮、附睾与附属腺体分泌的活性介质，含丰富酶与非酶抗氧化剂，其生化特征可能更早捕捉代谢紊乱，尤其在“不明原因”的精子异常病例中。
胆汁色素——血红素降解产物胆绿素（BV）与胆红素（BR），在其他器官被证实具有抗氧化与免疫调节作用，但在男性生殖系统的功能未明。虽知血红素加氧酶（HMOX1/HMOX2）与胆绿素还原酶A（BLVRA）在男性生殖道高表达，却无精浆中二者的精准定量数据。传统检测法（如Jendrassik–Grof法）灵敏度不足，高效液相色谱又繁琐。本研究创新应用日本鳗鱼源荧光蛋白UnaG衍生的HUG（HELP–UnaG）融合探针，无需有机溶剂提取即可在复杂基质中高特异、高灵敏地同步测定BV与BR，填补了空白。
研究对象为斯洛文尼亚马里博尔大学医学中心接受不孕评估的42例男性伴侣（24–50岁），排除梗阻性无精子症、泌尿生殖感染等。按WHO第六版标准采集液化后精液，离心分离精浆，?80℃冻存。HUG检测经加标回收验证无基质干扰，BV/BR稳定性达6个月；通过UnaG结合BR直接测BR，再以BLVRA/NADPH将BV转化为BR后反推BV浓度，最终获得每份精浆的BV/BR水平，并与精子参数关联分析。
3.1. 研究人群与精液样本特征
参与者中位年龄35.5岁，中位BMI 26.9 kg/m2，禁欲时间中位4天。精液体积、精子浓度、总计数、活力与形态均呈较大个体差异，涵盖正常精子症及各异常亚型（弱/少/畸形精子症）。
3.2. 精浆胆汁色素定量的分析验证
加标回收实验显示，BR与BV在低、中、高三个加标水平的实测值与预期值无显著差异，证明HUG在精浆中不受基质干扰。?80℃储存6个月后，BR浓度稳定，BV虽样本间变异稍大但无统计学变化，确认存储可行性。
3.3. 精浆中胆绿素与胆红素的浓度与分布
所有样本均检出BV与BR：BV范围51.8–611.2 nM（平均296.8 nM），BR范围19.7–240.7 nM（平均82.6 nM）。88.1%样本BV高于BR，BV/BR比值5.3±4.4；二者浓度无显著相关性，提示非血浆被动滤过，而是局部调控。
3.4. 胆汁色素与精液参数的关联
每射精总BV与总BR分别为1054 pmol与280 pmol。总BR与精子总数呈正相关（Rs=0.47），BV则无此关联。精浆pH与BV浓度（Rs=?0.47）、总BV量（Rs=?0.57）呈负相关。分层分析显示：少精子症组BR浓度与总量显著低于非少精子症组；畸形精子症组BV浓度显著升高，而BR无变化；弱精子症组两者均无差异。
研究首次实现人类精浆BV与BR的同步纳米级定量，突破传统方法局限。BV在多数样本占主导，不同于血液/脑脊液中BR为主的模式，体现组织特异性代谢。总BR与精子总数的正相关及少精子症组的降低，暗示BR或反映生精产出；BV在畸形精子症中的升高，可能与应激下HMOX1上调、氧化损伤有关。这些发现将胆汁色素定位为精浆氧化还原微环境的候选指标，而非直接因果证据。动物研究中，附睾上皮通过微囊泡向精子转移BLVRA，提示BV/BVRA系统可能在精子成熟中抵抗氧化损伤；体外试验也显示BV比BR更有效抑制H?O?诱导的脂质过氧化，与本发现的BV优势一致。
局限性包括样本量偏小、混杂因素未完全控制、横断面设计无法推断因果。但HUG技术为男性生殖研究开辟了新维度，未来需整合氧化应激标志物（如脂质过氧化物）、功能性精子检测与生育结局随访。
综上，该研究建立了精浆胆汁色素的分析框架，揭示其与精子质量的差异化关联，为探索血红素代谢在男性生育力中的作用奠定基础，有望推动精浆生化谱从常规参数向分子表型拓展。
