用于检测非扩增样本中抗金色花叶病转基因普通豆类的QCM基因传感器 Isabella C. S. Nascimento, Andressa M. Souza, Andrea P. Parente, Edna M. M. Oliveira, Andrea Valdman, Rossana O. M. Folly, Andrea M. Salgado

《Analytica》：QCM Genosensor for Detection of Golden Mosaic-Resistant Transgenic Common Beans in Non-Amplified Samples Isabella C. S. Nascimento, Andressa M. Souza, Andrea P. Parente, Edna M. M. Oliveira, Andrea Valdman, Rossana O. M. Folly and Andrea M. Salgado

　　摘要：开发了一种基于石英晶体微天平的生物传感器，用于特异性检测首个具有抗豆金色花叶病毒（BGMV）能力的转基因普通豆（L.）品种BRS FC401 RMD。该传感器的固定化过程依赖于硫醇化探针与金电极表面之间的强结合。探针序列位于引入普通豆基因组的BGMV rep基因区域内。通过合成寡核苷酸测试了传感器的分析性能，并对转基因和野生型豆种子进行了实际样品检测。样品预处理仅包括酶促片段化，随后进行热变性处理并结合使用阻断寡核苷酸。研究了不同的生物传感器再生方法。固定化过程表现出良好的重复性（CV%为5.8%）。该生物传感器对合成寡核苷酸和非扩增的基因组DNA均具有特异性。检测范围为0–1.4 ng/μL，检测限为0.18 ng/μL。经过三次连续检测后，传感器表面活性未受损。结果表明，该生物传感器具有直接、实时、无标记地检测DNA样本的潜力，适用于转基因普通豆品种的田间筛选。

1. 引言
巴西是全球主要的普通豆生产国之一。BRS FC401 RMD是世界上首个开发的转基因普通豆（Phaseolus vulgaris L.）品种，也是巴西唯一注册并获准具有抗金色花叶病毒能力的品种[1]。金色花叶病毒（BGMV）会导致叶片黄化、植株矮化、豆荚和籽粒变形以及花序脱落等症状，这是巴西主要的豆类病毒病害，导致产量损失高达40%至100%[2]。该转基因品种包含一个由411个碱基对组成的BGMV rep基因内含子发夹结构（GenBank Accession NC 004042，位置1836–2247），以表达形成发夹结构的RNA，其中包含双链区域。细胞机制将这种双链RNA（dsRNA）转化为小干扰RNA（siRNA），从而触发针对rep基因的病毒信使RNA（mRNA）的降解，这一过程称为RNA干扰。由于rep基因对病毒复制至关重要，其沉默可使植物对金色花叶病毒产生免疫[2,3]。BRS FC401 RMD在表型上与非转基因品种无异，因此曾引发关于其抗性丧失、与非转基因品种混杂或被其他同媒介病毒感染的担忧[4]。此外，根据欧盟（EU）、日本、澳大利亚、新西兰、泰国、中国和巴西等国家的生物安全和食品安全法规，转基因品种在整个生产链（从种子和谷物生产到包装和销售）都必须可追溯[5]。目前，用于检测转基因生物（GMOs）的最流行方法是聚合酶链反应（PCR），其中实时PCR是GMO定量金标准。但这些方法繁琐、昂贵且耗时，不适合在实验室基础设施有限的田间环境中进行常规分析[5]。因此，开发快速、低成本、易于使用且适用于田间的GMO检测工具至关重要[6]。作为传统方法的替代方案，DNA生物传感器（即基因传感器）备受关注。在各种转导方法中[7,8,9]，基于石英晶体微天平（QCM）的压电基因传感器因具有实时无标记检测、高灵敏度、简单性和低成本仪器等优点而成为最具前景的技术[10,11]。这类设备中，石英晶体夹在两个金电极之间，电极负责将反应表面与外部振荡电路连接起来，使石英晶体在其共振频率下振动[12]。QCM中的DNA检测通过测量传感器表面因DNA杂交而产生的质量变化来实现。频率变化与石英晶体表面沉积质量之间的线性关系由Sauerbrey方程描述[13]：
???=?2.3×10?6???20?????
其中????(H?z)表示晶体共振频率的变化，??0?(H?z)表示晶体的基本频率，???(c?m2)表示表面积，????(g)表示沉积的质量。因此，通过测量石英晶体的共振频率可以原位监测DNA的固定化、杂交和水解过程。这种质量敏感的QCM技术已在多项研究中成功用于检测GMOs[14,15,16,17]。因此，本研究的目的是利用石英晶体微天平技术开发一种能够检测BRS FC401 RMD并区分转基因与非转基因品种的基因传感器。该传感器采用无标记设计，可实现实时检测，无需复杂的样品处理和分析步骤，适用于微型仪器设备进行田间应用。传感器通过固定与转基因普通豆特征DNA序列互补的探针来制备。评估了硫醇-金相互作用及硫醇阻断溶液在固定化过程中的重复性，并对基因传感器的灵敏度、重复性、再现性和特异性进行了分析。此外，还研究了不同的生物受体再生方法。在巴西农业背景下，特别是针对转基因普通豆的监测，这种方法旨在简化检测流程、降低成本，并为实验室基础设施有限的地区提供更多分析工具。

2. 材料与方法
2.1. 化学试剂
盐酸（HCl）、硫酸（H2SO4）、过氧化氢（H2O2）、6-巯基-1-己醇（MCH）、氢氧化钠（NaOH）、盐水-磷酸钠-EDTA缓冲液（SSPE 20×）、乙醇和三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris–HCl）购自Merk（德国达姆施塔特）。十二烷基硫酸钠（SDS）、磷酸氢钾（KH2PO4）、溴化乙锭和琼脂糖购自Sigma-Aldrich?（西班牙马德里）。乙二胺四乙酸（EDTA）、硼酸三钠-EDTA（TBE 10×）缓冲液和盐水-柠檬酸钠（SSC 20×）缓冲液购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。所有实验中使用的缓冲液和溶液均使用Millipore Milli-Q?（西班牙马德里）纯化系统（25°C时电阻率为18.2 MΩ·cm）制备的超纯水配制。

2.2. 合成寡核苷酸
合成寡核苷酸的设计基于对BGMV rep基因序列的研究。图1显示了目标基因rep的序列以及用于特异性识别目标区域的硫醇化探针序列。同时标出了用于gDNA片段化的Alu I酶的共有序列。
表1列出了本研究中使用的合成寡核苷酸序列。所有寡核苷酸均购自GenOne Biotechnologies（巴西里约热内卢）。冻干样品溶解在超纯水中至最终浓度100 μM（pmol/μL），并储存在-20°C。目标序列和非互补序列均用于评估传感器的分析性能。阻断寡核苷酸用于基因组DNA（gDNA）的变性过程。

2.3. 基因组DNA
2.3.1. 基因组DNA提取
首先将豆粒（野生型和转基因型）研磨20秒（IKA A11 basic），以增加细胞裂解过程中遗传物质的暴露程度。然后使用三种商业试剂盒（ZymoBIOMICS、DNeasy Plant Pro、DNeasy mericon Food）按照推荐协议提取基因组DNA。使用NanoDrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific）通过测定A260/280和A260/230比值来定量和评估DNA纯度。接着在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳验证样品完整性，并使用Loccus Biotecnologia L.PIX Transilluminator（手动模式；分辨率为696 × 520；16位格式）进行拍照记录。最后将DNA储存在-20°C待用。
2.3.2. 酶促消化
提取后，使用FastDigest AluI限制性内切酶（Thermo Scientific?）对gDNA进行酶促消化。选择该酶是因为目标序列两侧存在限制性位点。反应在37°C下进行15分钟。未进行酶失活处理，消化后的DNA直接用于后续的变性步骤。
2.3.3. 带有阻断寡核苷酸的热变性
酶促消化得到的DNA片段呈双螺旋结构，需要将其双链分离（变性）以便与固定在传感器上的探针杂交。为了获得单链DNA，将消化后的DNA置于含有阻断寡核苷酸的溶液中进行热变性[18]。该方法结合了热解离效应和两个短寡核苷酸与热分离链的空间阻碍作用：一个寡核苷酸与含有目标序列的链结合，另一个与含有探针的链结合，从而防止链重新结合，使目标链可用于杂交。加入每种寡核苷酸50 μL（10 ng/μL）后，样品在95°C下孵育5分钟，然后在40°C下孵育1分钟。此温度适合寡核苷酸与互补DNA序列的结合。完成处理后立即将样品注入流式细胞仪。含有野生型DNA的样品作为阴性对照。

2.4. QCM晶体及实验装置
使用了一种AT切割的石英晶体谐振器（名义频率为10 MHz），在基本谐波下振荡（Novaetech S.r.l., 意大利庞贝），用于合成寡核苷酸和基因组DNA的压电测量。该装置厚度约为160 μm，总直径为13.9 mm，位于两个直径6 mm、厚度约200 nm的金电极之间。通过在金电极表面沉积一层钛（Ti）来增强金与石英表面的粘附力。石英晶体的名义灵敏度为4.42 × 10?9 g Hz?1 cm?2，热稳定性表现为23°C时频率变化±20 kHz。石英晶体先用含有H2O2（30%）和H2SO4（98%）的Piranha溶液（比例1:3）清洗，然后冲洗干净。晶体可立即使用或保存在无水乙醇中待用。石英晶体安装在流式细胞仪中，其共振频率由Novaetech S.r.l开发的开源石英晶体频率计（openQCM proximity electronic，1–25 MHz）连续记录。样品和溶液以特定流速（100–500 μL/min）通过流式细胞仪，使用开源精密蠕动泵输送。论文中报告的频率变化（?F）为两个稳定值之间的差值（±1 Hz）。所有测量均在受控实验室环境中进行，以减少外部干扰。同时使用OpenQCM软件（版本1.2）的实时温度监测功能监控环境温度，防止信号漂移。

2.5. 寡核苷酸探针在金电极上的固定
石英晶体的功能化按照先前研究[14,20]的方法进行，但有所改进。将固定化溶液（1 M KH2PO4，pH 3.8）注入流式细胞仪，直至达到稳定的基线频率。该溶液提供高离子强度，有助于静电屏蔽带负电荷的DNA骨架，并促进探针在金表面的密集固定[21]。随后加入50 μL相同溶液中制备的硫醇化探针（10 ng/μL），并保持循环2小时。表面改性是基于DNA探针通过形成金-硫醇键直接化学吸附到换能器表面。接下来，用固定溶液和水清洗晶体以去除未结合的探针，为阻塞步骤做准备。为了阻塞表面并防止非特异性吸附，将晶体用1毫升1 mM的硫醇（6-巯基-1-己醇，MCH）水溶液处理1小时。探针固定和表面阻塞过程都是在连续流速（100 μL/min）下循环每种溶液进行的。当获得稳定的频率信号时，记录频率值的变化。使用Sauerbrey方程来确定沉积在晶体表面的硫醇化探针和阻塞硫醇的质量。

2.6. 与合成寡核苷酸的杂交
使用合成寡核苷酸进行杂交，以表征基因传感器的分析能力，包括稳定性、特异性和重复性。将流式细胞器填充杂交缓冲液（SSPE 1×），并保持此状态直到基线稳定。杂交使用含有10 ng/μL互补合成靶标的溶液，在连续循环（100 μL/min）下进行30分钟。然后，用杂交缓冲液清洗晶体以去除未结合的靶分子。通过用1 mM HCl溶液处理1分钟（连续流速500 μL/min）来再生单链探针。最后，注入杂交缓冲液，重新建立后续检测循环所需的实验条件。

2.7. 与真实样本的杂交
首先通过酶解基因组DNA，以获得易于变性和被固定探针识别的片段。与寡核苷酸杂交的程序相同，但由于样本的复杂性有所不同。将样本在杂交缓冲液中稀释至约1.2 ng/μL。杂交反应进行30分钟。除了之前用于合成寡核苷酸的1 mM HCl处理外，还测试了NaOH（50 mM和100 mM）和200 mM Tris-HCl（pH 7, 0.1× SSC, 和0.1% p/v SDS）在真实样本杂交后的再生效果，同时改变温度和暴露时间（详见补充材料）。再生溶液以500 μL/min的连续流速注入流式细胞器。

3. 结果与讨论
3.1. 电极功能化
通过直接使石英晶体的金表面与硫醇化探针溶液相互作用来实现固定。将硫醇化探针涂覆在金表面的驱动力是由于形成了强硫醇-Au键，其化学吸附能量约为50 kcal/mol [22]。这种技术简单直接，可能是最广泛用于在基于金的分子检测平台上固定生物受体的表面化学方法 [23]。QCM金电极作为转换接口，固定过程可以实时观察，无需标记系统。在本研究中，10 ng/μL的硫醇化探针固定2小时后，观察到频率变化为?162 ± 9 Hz，变异系数（CV%）为5.8%（n = 3；在连续三天内进行实验）。这个值与文献结果 [14] 一致，并表明晶体清洗、溶液制备和流动条件控制的程序是可靠的。根据Sauerbrey方程（??? =????? ×???），对于一个标称灵敏度为4.42 × 10?9 g Hz?1 cm?2的10 MHz石英晶体，频率降低1 Hz对应于质量增加1.25 ng。因此，估计的化学吸附质量约为203 ng，相当于探针密度为5.6 × 1013分子× cm?2（硫醇化探针的分子量；7691 g/摩尔）。在用硫醇化探针固定后，将晶体用1 mM MCH处理1小时（连续流速100 μL/min），以控制表面密度并去除非特异性相互作用 [24]。与MCH处理相关的频率变化为+46 ± 4 Hz，表明部分探针脱附和单层重组。通过使用10 ng/μL的互补DNA在1x SSPE缓冲液中杂交来评估表面活性。杂交信号为?35 ± 4 Hz（n = 3），对应的杂交比率约为30%（计算为（????????????????????????????????????????/????????????????????????????????????????????）×100，在MCH钝化后调整）。QCM生物传感器中通常观察到的杂交比率范围为30%到80%，取决于探针设计、表面化学和实验条件 [25,26]。特别是对于硫醇修饰探针的杂交，报道的比率为40–42% [26]。这些结果突出了通过微调探针密度来平衡单层稳定性、重复性和杂交可用性的优化机会。可能的优化措施包括降低固定液中的探针浓度或减少暴露时间，从而得到密度较低的单层和与目标的更有利的相互作用。另一种可能性是关注阻塞剂的浓度：过量时，它可能会将探针从QCM表面置换出去，减少后续的杂交。在低浓度下，探针可能不会保持直立方向，从而降低其与目标的结合能力 [27]。另外，降低流速可以减少质量传输，导致单层更不紧凑 [28]。所有这些结合表面研究（原子力显微镜（AFM）、X射线光电子能谱（XPS）等），可以更详细地研究每个变量对电极功能化的影响。优化研究正处于实验规划阶段，结果将在未来的工作中呈现。

3.2. 生物传感器的分析性能
使用合成寡核苷酸的标准溶液评估了所开发生物传感器的分析性能，包括灵敏度、重复性和特异性。如图3所示，使用浓度范围为0–10 ng/μL的互补靶标获得了校准曲线。传感器在0–1.4 ng/μL浓度范围内表现出线性行为，回归方程为?F (Hz) = (11.909 ± 0.829) C (ng/μL) + (0.897 ± 0.680)，相关系数R2 = 0.986。互补靶标的实验检测限（LOD）根据标准表达式???????? =3???/??计算得出，其中??是空白值的标准差（n = 5），??是校准曲线的斜率。LOD确定为0.18 ng/μL。图3. 通过硫醇化探针/阻塞硫醇固定程序获得的互补靶标检测校准曲线。通过在同一电极上使用相同的互补靶标浓度（10 ng/μL）进行五次连续测量来评估生物传感器的重复性。通过以500 μL/min的流速注入1 mM HCl进行电极再生。平均频率变化为?30 Hz，标准差为±2 Hz，变异系数为6%。类似的研究报告使用相同再生溶液的CV为8%（n = 4）[17] 和11%（n = 3）[20]。因此，观察到的低变异性表明系统的良好重复性，并证实了由于ssDNA在石英晶体表面杂交而产生的检测信号的稳定性。通过在相同实验条件下对三个独立电极进行三次检测测试来研究重复性。观察到频率变化为?35 Hz，标准差为±4 Hz。CV为11%表明设备间的良好重复性。尽管这个值略高于重复性观察到的值，但仍处于压电DNA生物传感器文献报告的范围内 [16,29]，表明制造和固定过程的稳健性。观察到的变化可能与探针密度的轻微差异、自组装单层的异质性以及不同电极间的杂交效率差异有关。特异性是通过比较生物传感器对10 ng/μL互补靶标DNA的响应与两个非互补序列的响应来证明的。如图4所示，注入非互补序列产生的信号可以忽略不计（<1 Hz），表明在没有序列互补性时没有显著的频率变化。相比之下，注入互补靶标序列时观察到明显的频率变化。这些结果证实了生物传感器能够特异性地识别目标DNA。这种特异性对于设备的适用性至关重要，确保只检测到基因修饰的目标，同时最小化假阳性。

3.3. 基因组DNA提取
对于生物分子分析中的每种DNA检测和/或定量方法，必须有一个适用于样本矩阵的提取方案，并对其进行测试和验证。表2展示了使用三种商业试剂盒从转基因豆粒中提取基因组DNA的结果。提取的本质是获得足够数量且质量适当的DNA以供后续分析。质量指的是提取DNA的长度、结构完整性和物理化学纯度 [30]。表2. 使用NanoDrop分光光度计进行的gDNA分析结果。试剂盒I和II显示出相似的平均提取产量，表明在从植物基质中裂解和回收基因组DNA方面效率相当。然而，试剂盒II在重复实验之间的重复性较低。另一方面，试剂盒III的产量是前两者的两倍。所有提取物的A260/280比率大于1.7，表明这三个试剂盒都能有效去除蛋白质，因为1.7到2.0之间的值被认为是纯DNA的标志。通过测量260和280纳米处的吸光度比率（A260/280）来评估DNA纯度是一种广泛使用的技术，例如，用于指示残留肽和酚类化合物的存在。这些化合物在280纳米处有强烈的吸收，当它们与在260纳米处吸收的DNA共存时，会导致A260/280比率降低 [15]。A260/A230比率表现出不同的行为：所有样本的值都低于理想范围（2.0–2.2），表明存在优先在230纳米处吸收的残留污染物，如脂质、盐和酚类 [30]。通过琼脂糖凝胶电泳（图5）评估从豆粒中提取的提取物的完整性。分析了八个样本。图5. 使用商业试剂盒ZymoBIOMICS、DNeasy Plant Pro和DNeasy mericon Food从转基因卡里奥卡豆粒中提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳。所有样本在凝胶顶部附近显示出强烈的条带，这是高分子量的区域，表明存在结构良好的基因组DNA [16]。例外的是使用试剂盒II提取的样本6，其条带强度降低，表明提取的DNA量较少。提取方法和样本特性影响提取DNA的产量和质量，这两者对GMO检测和定量结果至关重要。总体而言，试剂盒III显示出更好的产量和纯度。然而，尽管纯度比率是样本质量的重要指标，但核酸质量的最佳指标是其在其后续应用中的功能性 [16]。因此，所有样本都经过了酶解步骤和检测测试，以评估获得的信号质量。

3.4. 样本预处理：酶切片段化和热变性结合寡核苷酸
对于需要短片段进行快速杂交和高灵敏度目标检测的样本，DNA片段化和变性是必要的预处理步骤 [31]。植物基因组DNA是一种结构复杂、长度长且难以分离的分子，这在空间上阻碍了目标序列与结合在晶体表面的探针的接近 [32]。因此，提取后使用限制性内切酶FastDigest AluI对gDNA进行酶解。选择这种酶是因为目标序列的侧翼区域存在限制位点，可以生成138个碱基对的片段。获得的片段长度比类似研究中报告的要短（大约400–900 bp）[20,32]。值得注意的是，较小的片段在与探针结合时倾向于表现出更大的扩散移动性和较小的空间阻碍。高温热变性程序（95 °C处理5分钟，然后在冰中冷却1分钟）在杂交测定中广泛描述 [14]。然而，这种方法可能不适用于那些使用流动系统进行样品注入的仪器实验[18]，例如本研究中开发的仪器。这一限制是由于变性DNA链在接触传感器表面之前会迅速重新退火。因此，消化后的样品需要经过与寡核苷酸共同作用的热变性处理。在这种策略中，变性后，DNA在寡核苷酸退火温度（40°C）下孵育1分钟。这些寡核苷酸与单链DNA（ssDNA）的结合减缓了重新退火的过程，从而增加了变性序列可用于杂交的时间。样品预处理的有效性是通过分析杂交信号来推断的。

3.5. 与未扩增的gDNA样品的杂交
在消化后的DNA样品中，目标序列的拷贝数减少，并嵌入到高度复杂的基因组DNA片段矩阵中。尽管如此，生物传感器仍能检测到所有分析样品中的互补序列。这一结果表明，样品预处理策略——包括提取、酶消化和热变性以及使用阻断寡核苷酸——能够有效地使目标序列以适合分子识别的形式存在。

在三种不同晶体中的重复性实验显示，杂交频率的变化范围为-40 ± 16 Hz，变异系数（CV%）为40%。需要注意的是，由于这些矩阵的复杂性不同，无法直接比较实际样品和合成寡核苷酸样品的信号变异系数。虽然合成寡核苷酸构成了定义明确且均匀的系统，但从植物基质中提取的基因组DNA则是一个复杂的混合物，其中包含提取过程中的残留污染物以及预处理步骤中的固有变异性，所有这些因素都会增加分析信号的分散。

不同提取试剂盒的比较显示，杂交信号强度与提取方法之间没有直接相关性。尽管观察到DNA产量和纯度的差异，特别是在使用DNeazy mericon Food试剂盒时，但这些变化并未显著反映在最终的生物传感器响应中。

通过使用经过相同提取、消化和热处理的野生型DNA作为阴性对照，确认了生物传感器的特异性。在这些条件下，观察到的频率偏移可以忽略不计（≤4 Hz，n = 3）。这种小的频率偏移可能是由于DNA直接吸附在金电极上而没有与探针发生杂交，或者是探针与复杂样品中的部分互补序列之间的弱非特异性相互作用所致。

3.6. 表面再生
为了在与gDNA杂交后再生生物受体，评估了使用1 mM HCl、NaOH（50 mM和100 mM）和200 mM Tris-HCl（pH 7）以及0.1× SSC和0.1% w/v SDS的不同方法。每种方法都进行了三次实验。每种处理的效率通过杂交前的基线恢复百分比来评估（数据见补充材料）。1 mM HCl和50 mM NaOH处理没有实现再生；只有100 mM NaOH（25°C）和200 mM Tris-HCl（含0.1× SSC和0.1% w/v SDS，95°C）处理10分钟后，再经过SSPE 1×（95°C）处理3分钟，未能完全去除杂交的目标DNA，导致表面活性降低。另一方面，使用I（100 mM NaOH（25°C）处理1分钟 + 200 mM Tris-HCl（含0.1× SSC和0.1% w/v SDS，25°C）处理2分钟）和II（200 mM Tris-HCl（含0.1× SSC和0.1% w/v SDS，95°C）处理10分钟 + H2O（95°C）处理15秒）的方法，再生百分比超过了100%，表明除了去除杂交的目标DNA外，还部分去除了固定在传感器表面的探针。

处理I是对先前报道的处理[20]的改进，延长了每种溶液的接触时间。这些处理利用100 mM NaOH的碱性来破坏双链DNA（dsDNA）的氢键，将其转化为单链DNA（ssDNA）[31]，并结合Tris-HCl缓冲液（pH 7, 0.1× SSC和0.1% w/v SDS），在有效清洁和保持固定核酸完整性之间取得平衡。最初，在较短的接触时间内，仅实现了部分表面再生（约42%）。随着接触时间的延长，不仅去除了杂交的目标DNA，还部分去除了传感器层。这些结果表明，可以确定一个最佳的接触时间，以实现生物受体的有效再生，同时保持其表面活性。

通过两次再生/杂交循环后分析信号的保留百分比来评估表面的分析能力（n = 3）（图6）。图6显示，经过两次再生/杂交循环后，分析信号的保留百分比约为初始值的93 ± 2%。相比之下，处理II导致的信号损失为51 ± 6%。这种差异归因于处理II中使用的较温和的化学条件，其中仅利用热效应来促进DNA链的分离，并结合Tris-HCl缓冲液（pH 7, 0.1× SSC和0.1% w/v SDS）。使用温度诱导DNA变性是一种成熟的技术，如果控制得当，不会对核酸的完整性造成不可逆的损害[31]。尽管信号逐渐减弱，但在处理II后，信号仍能明显区分于噪声和阴性对照，从而在所有评估的循环中都能明确识别出分析物。这种行为表明，尽管功能层部分降解，但仍有相当一部分探针保持活性并可用于分子识别。至少可以进行三次杂交反应而无需重新固定。

4. 结论
在这项工作中，开发了一种基于QCM的基因传感器，用于检测抗金色花叶病的普通豆类。通过将BGMV rep基因区域内的序列固定在QCM传感器表面，该系统实现了从未扩增样品中选择性地、灵敏地检测转基因事件。尽管仍存在一些挑战，但所开发的生物传感器引入了一种无需标记物、无需复杂样品制备或分析程序即可实时检测转基因事件的检测方法。该检测方法适用于微型仪器，特别适合现场应用。在巴西农业中，这种方法可以加快对改良普通豆类的监测速度，降低成本，并将分析范围扩展到实验室基础设施较少的地区。

补充材料
以下支持信息可在此下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/analytica7020028/s1
- 表S1. 用于与基因组DNA杂交后生物受体再生的方法[14,18,20]。
- 表S2. 两次再生/杂交循环后的频率偏移和分析信号保留百分比。
- 图S1. 与NCBI数据库及Phaseolus vulgaris、Phaseolus angularis和Phaseolus vulgaris L.基因组的BLASTn分析结果。