《Biology》：Tick-Borne Bacteria and Protozoa in Ixodes ricinus Ticks Collected from Fallow Deer (Dama dama) in a Central Italian Protected Area
Valentina Virginia Ebani,
Fabrizio Bertelloni,
Paolo Bongi,
Chiara Trebino,
Fabio Macchioni,
Marco Del Frate,
Marco Apollonio and
Francesca Mancianti
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本研究针对意大利中部人兽共居保护区的蜱传病原体传播风险，以黇鹿(Dama dama)体表采集的475只雌性蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)为对象，通过PCR检测Anaplasma phagocytophilum、Borrelia sp.等6类病原体。结果显示68.92%蜱池阳性，其中A. phagocytophilum检出率最高(58.78%)，并首次在该区域发现B. miyamotoi与B. lusitaniae共流行。研究为野生动物-蜱-环境界面的One Health监测提供了关键数据。
在意大利托斯卡纳大区的米利亚里诺-圣罗萨诺-马萨丘科利区域公园内，游客们正享受着森林徒步的乐趣，却不知脚下湿润的落叶层中潜伏着微小的威胁——蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)。这种被称为"森林吸血鬼"的节肢动物，不仅是欧洲分布最广的蜱种之一，更是多种致命病原体的超级载体。从能引起莱姆病的Borrelia burgdorferi sensu lato(s.l.)复合体，到导致粒细胞无形体病的Anaplasma phagocytophilum，再到引发Q热的Coxiella burnetii，这些病原体通过蜱叮咬悄然传播，构成复杂的人兽共患病网络。
尽管已知黇鹿(Dama dama)等野生反刍动物是蜱的主要宿主，但其作为"无声携带者"在病原体传播链中的具体作用仍不明确。特别是在圣罗萨诺庄园这样的半城市化保护区，春季黇鹿密度高达42.8头/平方公里，历史上甚至达到99.8头/平方公里的峰值，这种高密度种群是否会加剧蜱媒疾病的传播风险？传统监测多聚焦于游离蜱，而对宿主体表寄生蜱的病原体携带情况缺乏系统研究。更棘手的是，B. miyamotoi等新兴病原体近年才进入科学家视野，其在意大利中部的流行状况几乎是一片空白。
为解开这些谜题，由Valentina Virginia Ebani领衔的国际研究团队在《Biology》发表突破性成果。他们选择圣罗萨诺庄园这个典型的人兽共居生态系统，通过系统采集黇鹿体表的蜱虫样本，结合分子生物学技术，绘制出该区域蜱传病原体的精细分布图谱。研究发现不仅揭示了A. phagocytophilum的高流行特征，更首次在该区域鉴定出B. miyamotoi和B. lusitaniae两种伯氏疏螺旋体，同时发现23.64%的蜱池存在多重病原体共感染现象。这些发现为评估保护区公共卫生风险提供了关键科学依据。
主要技术方法
研究采用横断面调查设计，于2022年7-12月在圣罗萨诺庄园采集148头黇鹿体表的475只成年雌性蓖子硬蜱，按宿主个体分装为148个蜱池。通过形态学鉴定确认蜱种后，采用Zimo Research DNA提取试剂盒进行核酸分离。针对6类目标病原体设计特异性PCR检测体系：包括A. phagocytophilum、Borrelia sp.、C. burnetii、Francisella tularensis、Hepatozoon sp.及梨形虫(piroplasms)，其中A. phagocytophilum和Borrelia sp.采用巢式PCR扩增。阳性扩增产物送外部实验室测序，序列经BioEdit软件拼接后通过BLAST比对GenBank数据库进行物种鉴定。所有PCR反应设置阴性对照和商品化阳性对照，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证。
研究结果
3. Results
所有采集蜱虫均鉴定为成年雌性蓖子硬蜱。148个蜱池中102个(68.92%)检出至少一种病原体：C. burnetii阳性3个(2.02%)，Borrelia sp.阳性21个(14.19%)，梨形虫阳性35个(23.64%)，A. phagocytophilum阳性87个(58.78%)。F. tularensis和Hepatozoon sp.在所有样本中均为阴性。67个(45.27%)蜱池仅检出单一病原体，35个(23.64%)蜱池检出两种及以上病原体，包括5个(3.38%)同时阳性A. phagocytophilum、Borrelia sp.和梨形虫，21个(14.19%)阳性A. phagocytophilum和梨形虫，8个(5.4%)阳性A. phagocytophilum和Borrelia sp.，1个(0.67%)阳性C. burnetii和梨形虫。
28个(18.91%)梨形虫扩增产物测序显示与西班牙和葡萄牙发现的Theileria sp. OT3(DQ866840, OL442188)100%同源，代表性序列已提交GenBank(PZ028472)；其余7个(4.73%)扩增产物与Theileria cervi(HQ184411)99.12%同源，代表性序列提交GenBank(PZ044513)。
21个Borrelia扩增产物测序显示：6个(4.05%)为B. miyamotoi，与法国里维埃拉分离株(MW301924)99.27%同源，与捷克和荷兰的I. ricinus分离株(KJ847049, CP044783)98.47%同源，代表性序列提交GenBank(PZ028451)；8个(5.4%)为B. lusitaniae，与斯洛文尼亚蜱分离株(OZ251982)99.84%同源，代表性序列提交GenBank(PZ028467)；剩余7个(4.73%)扩增产物与法国里维埃拉发现的Borrelia sp.(MW391922)100%同源，与赞比亚分离的B. theileri(LC656245)99.37%同源，代表性序列提交GenBank(PZ028469)。
4. Discussion
本研究证实蓖子硬蜱是意大利中部黇鹿种群中最主要的蜱种，这与该区域森林落叶层湿度适宜、中小型哺乳动物宿主丰富的生境特征相符。A. phagocytophilum 58.78%的高检出率与此前意大利不同地区4.4%-63.7%的报道范围一致，显著高于同区域黇鹿脾脏组织3.08%的检出率，提示蜱虫作为媒介更能反映病原体循环强度。该病原体主要引起马、犬和反刍动物疾病，也可导致人类粒细胞无形体病。
Borrelia sp. 14.19%的检出率较低，可能与黇鹿作为无能力宿主(incompetent hosts)的特性有关。测序鉴定的B. miyamotoi属于回归热(RF)群伯氏疏螺旋体，2018年才首次在意大利阿尔卑斯山区发现，本次检出进一步扩展了其在南欧的分布范围。B. lusitaniae属于B. burgdorferi s.l.复合体，其天然传播循环涉及蓖子硬蜱和蜥蜴宿主，这两种病原体均可引起人类发热性疾病。
C. burnetii 2.02%的检出率虽低，但证实其在意大利中部存在局部循环。值得注意的是，该病原体在蓖子硬蜱中的流行率显著低于革蜱属(Dermacentor marginatus, 14%)和扇头蜱属(Rhipicephalus turanicus, 25%)，提示蓖子硬蜱并非其主要传播媒介。F. tularensis和Hepatozoon sp.的零检出与欧洲多数研究结果一致，后者在鹿科动物中的流行率通常低于0.5%。
梨形虫检测未发现Babesia sp.，但鉴定出Theileria sp. OT3和T. cervi两种泰勒虫。前者在欧洲鹿科动物和绵羊中均有报道，但具体传播媒介和致病性尚未明确；后者具有跨物种传播潜力，曾在马科动物中分离得到。23.64%的蜱池存在多重病原体共感染，这可能增加宿主感染风险和疾病严重程度，导致非典型临床表现，给诊断带来挑战。
从One Health视角看，A. phagocytophilum和Borrelia sp.(含B. miyamotoi)在休闲活动频繁的保护区检出，提示存在公共卫生风险。这些病原体引起的发热症状缺乏特异性，易漏诊误诊。C. burnetii的检出提示气溶胶传播途径的潜在风险。研究局限性在于仅分析了蓖子硬蜱成虫阶段，未来需扩大宿主范围和蜱发育阶段监测。
结论与意义
本研究系统阐明了意大利中部保护区黇鹿寄生蜱中6类重要病原体的流行特征，首次在该区域发现B. miyamotoi和B. lusitaniae的流行，证实23.64%的蜱存在多重病原体共感染。这些发现不仅填补了南欧地区新兴蜱传病原体流行病学数据的空白，更为野生动物-蜱-环境界面的One Health监测提供了范式。研究结果提示，在人口密集的欧洲自然保护区，蜱传疾病防控需同时关注传统病原体和新发病原体，采取针对性的预防措施。该研究建立的蜱池检测策略，为资源有限地区的病原体监测提供了经济高效的解决方案，对全球蜱传疾病防控具有重要参考价值。
