《Biochemistry and Biophysics Reports》：Vaccination modality and injection site influence the immune response and protection against sea lice Lepeophtheirus salmonis infestation in Atlantic salmon (Salmo salar)
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为应对鲑海虱侵染对鲑鱼养殖业的重大挑战，研究人员评估了重组过氧化物酶蛋白LsPxtl-1、LsPxtl-2与全虱粗蛋白疫苗，探究腹腔注射与背鳍基部皮下注射（IP-F）联合给药方式对免疫应答与保护效果的影响。结果表明，LsPxtl-1疫苗能显著降低虱数，IP-F给药可诱导更强的黏膜IgT应答，提示局部免疫在防护中可能发挥作用。该研究为优化鲑海虱疫苗的抗原、剂型与递送策略提供了关键见解。
在蔚蓝的挪威海域，大西洋鲑（Salmo salar）的养殖产业正面临一个顽固的“吸血鬼”——鲑海虱（Lepeophtheirus salmonis）的持续侵扰。这些微小的甲壳类寄生虫附着在鲑鱼体表，吸食其体液与组织，不仅导致鱼体应激、生长减缓、继发感染，更给养殖业带来了巨额的经济损失。传统的防治手段，如化学药物，因耐药性问题已逐渐失效；而机械、热力等物理方法则操作繁琐，易对鱼类造成应激与伤害。因此，开发安全、高效的海虱疫苗，已成为水产养殖领域迫在眉睫的需求。然而，尽管鱼类在自然感染后能产生抗体，但水平较低，不足以提供有效保护。如何通过疫苗接种，激发鱼类产生“正确”且强效的免疫应答，特别是针对寄生虫主要附着部位（皮肤、鳍）的局部黏膜免疫，成为了研究的关键突破口。为此，挪威生命科学大学的研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》上发表了一项研究，深入探究了不同抗原来源与疫苗接种方式如何影响大西洋鲑的免疫应答及其对海虱侵染的保护效果。
本研究主要运用了重组蛋白制备、动物免疫与攻毒实验、以及多种免疫学检测技术。研究人员首先从海虱中克隆并表达了两种重组过氧化物酶样蛋白（LsPxtl-1和LsPxtl-2），并制备了全海虱粗蛋白（WSL）抗原。随后，将平均体重约81.6克的大西洋鲑分为多个实验组，分别通过单纯腹腔注射（i.p.）或腹腔联合背鳍基部皮下注射（IP-F）的方式接种不同疫苗。所有鱼在免疫后经历驯化并转入海水，于免疫后约98天用海虱桡足幼体进行攻毒挑战。在试验终点，采集鱼的血浆和皮肤黏液样本，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测针对海虱抗原的系统性（血浆）和黏膜（黏液）抗体应答，包括总免疫球蛋白（IgM/IgT）和特异性免疫球蛋白T（IgT）的水平。同时，统计每条鱼体表的海虱数量，以评估疫苗的保护效力。数据分析采用了负二项回归等多种统计方法。
3.1. 疫苗接种与攻毒试验
研究人员设置了包含重组蛋白疫苗（LsPxtl-1, LsPxtl-2, 两者混合）、全虱蛋白疫苗（IP, IP-F）及相应对照组（PBS, PET载体蛋白）在内的多个实验组。结果显示，除了LsPxtl-2组的鱼体重显著较轻外，各组间体重和体长无显著差异，表明疫苗接种本身对鱼的基础生长状况影响不大。
3.2. 抗体验证
通过蛋白质印迹（Western blot）验证了所用检测抗体的特异性。定制的兔抗鲑鱼IgT抗体在非还原条件下识别出约180 kDa的条带（完整IgT），在还原条件下识别出重链（~75 kDa）和轻链（~25-30 kDa）。商品化的小鼠抗鲑鱼免疫球蛋白抗体则能在非还原条件下同时识别IgM（>220 kDa）和IgT（~180 kDa），证实了检测方法的可靠性。
3.3. 海虱数量
对攻毒后鱼体附着的海虱（前成虫期）进行计数统计。数据显示，LsPxtl-1疫苗组的海虱平均数最低（24.6个），而仅腹腔注射全虱蛋白的IP组最高（37.2个）。核密度图显示所有组的虱数分布均呈多模态，表明个体差异较大。通过负二项回归分析比较发现，LsPxtl-1疫苗组的虱数显著低于PBS对照组（p < 0.05），而IP-F组相较于PBS对照组也呈现出降低虱数的趋势（p = 0.074）。其他疫苗组与各自对照组相比无显著差异。
3.4. 疫苗接种后的局部与系统性抗体应答
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3.4.1. 海虱特异性血浆抗体
疫苗接种诱导了显著的系统性抗体应答。弦图与数据表汇总显示，接种全虱蛋白疫苗的IP和IP-F组，其血浆中针对海虱的总IgM/IgT和特异性IgT水平均为所有组中最高。重组蛋白疫苗（LsPxtl-1, LsPxtl-2）也能诱导显著高于对照组的血浆总IgM/IgT水平，但其血浆特异性IgT水平与对照组无显著差异。小提琴图直观展示了抗体水平在不同组内的分布情况。
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3.4.2. 黏液中的海虱特异性抗体
与血浆相比，黏液中的抗体应答整体较弱。全虱蛋白疫苗（IP和IP-F）能够诱导显著高于对照组的黏液总IgM/IgT和特异性IgT应答，且IP-F组中能检测到黏液IgT的“应答者”比例（60%）高于IP组（33%）。而重组蛋白疫苗在黏液中所诱导的抗体水平很低，大多为“无应答者”。值得注意的是，未接种疫苗的PBS对照组中，也有相当比例的鱼（约44-50%）在攻毒后能检测到黏液IgT，提示侵染本身可能诱发局部IgT反应。
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3.4.3. 测量的抗海虱抗体应答与虱数之间的关系
相关性分析显示，无论是血浆还是黏液中的抗体水平（总IgM/IgT或特异性IgT），均与鱼体最终附着海虱的数量无显著统计相关性。这表明，本研究中检测到的抗体水平本身并不能直接预测或解释疫苗提供的保护程度。
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3.4.4. 按高-低虱数分组的抗体水平
为进一步探究，研究人员根据虱数中位数（25个）将鱼分为高、低虱数两个亚组进行分析。在接种全虱蛋白的IP-F组中，一个有趣的现象被发现：在低虱数亚组，黏液IgT水平较高；而在高虱数亚组，黏液IgT水平随着虱数增加呈正相关趋势。这暗示对于采用IP-F方式接种的鱼，侵染压力本身可能会进一步刺激局部IgT的产生。
4. 讨论
本研究证实，抗原来源（重组蛋白 vs. 全虱蛋白）和疫苗接种方式（单纯腹腔注射 vs. 腹腔联合背鳍注射）确实影响了大西洋鲑对海虱的免疫应答和保护效果。表现最佳的重组LsPxtl-1疫苗和采用IP-F方式给药的全虱蛋白疫苗，均能显著或趋向于降低攻毒后的海虱数量。然而，这种保护作用与检测到的系统性或黏膜抗体水平缺乏直接关联，说明可能还有其他未被测定的免疫机制（如细胞免疫、补体系统或其他炎症因子）在保护中扮演了关键角色。
研究特别关注了黏膜免疫球蛋白IgT的作用。背鳍基部皮下注射（IP-F）的引入，是基于鱼类鳍组织属于皮肤相关淋巴组织（SALT）的一部分，且海虱偏好附着于背鳍区域的理论。结果显示，IP-F给药改变了局部抗体应答的模式，促使免疫应答向产生更多IgT的方向倾斜，这可能是其保护效果优于单纯腹腔注射（IP）的原因之一。尽管这种IgT应答与虱数减少的直接因果关系尚未明确，但它为通过局部免疫途径增强疫苗效力提供了新思路。
对于LsPxtl-1抗原，其保护效果证实了其作为疫苗候选靶点的潜力。作为一种在虱子发育中起重要作用的过氧化物酶样蛋白，针对它的免疫应答可能干扰了海虱的正常生理或附着过程。研究也指出了当前工作的局限性，例如黏液样本采集方法可能不够优化导致抗体检出率低，抗体检测仅在试验终点进行而无法区分疫苗诱导与感染诱导的应答，以及未设置单独的背鳍注射组等。
5. 结论
综上所述，该项研究系统地评估了不同抗原与接种策略对大西洋鲑抗海虱免疫保护的影响。核心结论是：重组过氧化物酶样蛋白LsPxtl-1作为抗原，以及采用腹腔联合背鳍基部的注射方式（IP-F），在实验条件下能够减少海虱的感染负担。保护效应的产生似乎不完全依赖于可检测的抗体水平，提示存在抗体之外的免疫保护机制。尤为重要的是，IP-F给药方式展现出了诱导更强黏膜IgT应答的潜力，这为开发旨在激发鱼类局部黏膜免疫的新型鲑海虱疫苗指明了极具价值的研究方向。未来，仍需对候选抗原、疫苗配方及递送策略进行进一步优化，并结合更全面的免疫指标分析，以期最终实现基于疫苗的、对鲑鱼养殖业海虱问题的可靠控制。
