引物酶亚基2通过MCM7/CDK4和Bax/Bcl-2通路调控胃癌细胞的增殖和凋亡

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Primase subunit 2 regulates the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells via MCM7/CDK4 and Bax/Bcl-2 pathways

PRIM2通过调控MCM7/CDK4和Bax/Bcl-2通路影响胃癌细胞增殖与凋亡，其高表达与患者预后不良相关。采用TCGA数据分析、细胞功能实验、蛋白质印迹及裸鼠移植瘤模型验证，发现PRIM2敲低抑制增殖并促进凋亡，过表达则相反，转录组学及通路验证进一步支持其机制。

　　

刘冰冰|王贤生|王月|张婷玉|郭荣亮|陈晓丹|张志伟

河北工程大学临床医学院，中国邯郸056000

摘要

背景

PRIM2（DNA引物酶亚基2）是DNA复制起始的关键调节因子，在多种癌症类型中表达异常，并促进肿瘤进展。

目的

本研究旨在探讨PRIM2在胃癌（GC）中的表达情况及其对细胞增殖和凋亡的影响，特别是通过MCM7/CDK4和Bax/Bcl-2通路。

方法

利用TCGA数据分析了胃癌（GC）及其邻近正常组织中的PRIM2表达情况，并通过Kaplan–Meier分析评估其预后价值。在GC细胞系中敲低或过表达PRIM2。Western blot检测PRIM2、MCM7、CDK4、Bax和Bcl-2。通过CCK-8、菌落形成和流式细胞术评估细胞增殖和凋亡。RNA-seq结合GO/KEGG分析以及裸鼠异种移植模型研究了相关通路和体内生长情况。

结果

PRIM2在GC组织和细胞系中高表达，其表达水平升高与GC患者的5年无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）较差显著相关。PRIM2敲低显著抑制AGS和HGC-27细胞的增殖，而PRIM2过表达则促进增殖。PRIM2敲低后凋亡增加。转录组分析显示PRIM2敲低主要影响MCM7/CDK4和Bax/Bcl-2通路，这一点通过Western blot进一步得到证实。体内实验表明，PRIM2敲低显著抑制了异种移植模型中的肿瘤生长。

结论

PRIM2通过MCM7/CDK4和Bax/Bcl-2通路调节GC细胞的增殖和凋亡。未来的研究应进一步探讨PRIM2与其他下游通路的相互作用，以及其在肿瘤组织中的具体作用机制。

引言

胃癌（GC）对全球医疗保健构成重大挑战，每年约有1,080,000例新病例和770,000例死亡[1]，[2]。东亚地区的风险最高，年龄标准化发病率超过25/100,000，占全球负担的近一半。虽然西方国家的发病率正在下降，但东欧和拉丁美洲的发病率仍高于15/100,000。临床上，约70%的患者在晚期才被诊断出来，导致5年总生存率（OS）低于30%[3]。靶向治疗与传统治疗方法的结合强调了识别驱动基因对于早期诊断和精准治疗的重要性，这可以显著改善患者预后[4]，[5]，[6]。

癌症的特征包括无限的复制潜力和生长信号的自我供给能力，这些对于维持肿瘤增殖至关重要[7]。引物酶（包括PRIM1和PRIM2亚基）对DNA复制至关重要，并显著促进癌细胞的生长和分裂。PRIM2（也称为PRIM2A或p58）是一种关键的调节亚基，参与DNA合成[9]。它是一种58 kDa的蛋白质，含有4个Fe4S簇，其表达水平与凋亡调节相关[10]，[11]，[12]。在多种癌症类型中报告了PRIM2的表达升高，包括非小细胞肺癌[13]、胶质瘤[14]、肝细胞癌[15]和急性髓系白血病[16]，其中它促进了细胞生长和增殖[13]。此外，PRIM2与细胞周期进展和PI3K/AKT信号通路相关，研究表明PRIM2敲低可降低胰腺导管腺癌中的PI3K和AKT表达[17]。PI3K/AKT通路是胃肠道肿瘤增殖、细胞周期进展和侵袭的关键调节因子，其失调会影响多种病理过程，包括DNA复制[13]、细胞周期控制[14]、[18]、铁死亡[19]和铜死亡[20]。在胃癌中，靶向FOXA1/CLDN4轴已被证明可以调节PI3K/AKT通路，从而抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移[21]。此外，研究表明VEGF-A和bFGF可以激活生长因子受体VEGFR2和FGFR1，驱动增殖和分化[22]，而与细胞死亡相关的转录特征被认为是胃癌腺癌的重要预后标志物[23]。然而，尽管PRIM2在其他癌症中的作用已被证实，但其在胃癌进展中的具体功能、机制贡献和下游通路仍很大程度上未明确，这代表了重要的知识空白。

RNA测序（RNA-seq）已成为一种强大的转录组工具，用于高分辨率分析基因表达，能够系统地发现癌症研究中的差异表达基因（DEGs）和通路失调。通过捕获整个转录组中的编码和非编码RNA，RNA-seq比传统微阵列具有更高的灵敏度和动态范围，有助于识别与肿瘤发生和治疗反应相关的新型分子特征[24]。在本研究中，我们使用RNA-seq分析了PRIM2敲低后GC细胞的转录图谱，以揭示其在细胞增殖和凋亡中的调节作用。

基于PRIM2在DNA复制和细胞周期调节中的作用，我们假设PRIM2通过增强增殖和抑制凋亡来促进GC进展，可能通过MCM7/CDK4通路和Bax/Bcl-2轴实现。本研究的主要目的是实验验证PRIM2在GC细胞生长和存活中的功能作用，并确定其关键的下游调节机制。这些发现为将PRIM2作为GC的潜在治疗策略提供了机制基础。

部分摘要

胃癌（GC）对全球医疗保健构成了重大挑战，对人们的生命构成严重威胁，每年约有1,080,000例新病例和770,000例死亡[1]，[2]。东亚地区的风险最高，年龄标准化发病率超过25/100,000，占全球负担的近一半。虽然西方国家的发病率正在下降，但东欧和拉丁美洲的发病率仍高于15/100,000。临床上，约70%的患者在晚期才被诊断出来，导致5年总生存率（OS）低于30%[3]。靶向治疗的出现与传统治疗方法相结合，突显了识别驱动基因对于早期诊断和精准治疗的重要性，这可以显著改善患者预后[4]，[5]，[6]。

癌症的特征包括几个已确立的标志，其中无限的复制潜力和生长信号的自我供给能力对于维持肿瘤增殖至关重要[7]。这些过程严重依赖于DNA复制和修复的适当调节[8]。引物酶由PRIM1和PRIM2亚基组成，对DNA复制至关重要，并显著促进癌细胞的生长和分裂。PRIM2（也称为PRIM2A或p58）作为参与DNA合成的关键调节亚基[9]。它是一种58 kDa的蛋白质，含有4个Fe4S簇，其表达水平与凋亡调节相关[10]，[11]，[12]。在多种癌症类型中报告了PRIM2的表达升高，包括非小细胞肺癌[13]、胶质瘤[14]、肝细胞癌[15]和急性髓系白血病[16]，其中它促进了细胞生长和增殖[13]。此外，PRIM2与细胞周期进展和PI3K/AKT信号通路相关，研究表明PRIM2敲低可降低胰腺导管腺癌中的PI3K和AKT表达[17]。PI3K/AKT通路是胃肠道肿瘤增殖、细胞周期进展和侵袭的关键调节因子，其失调会影响多种病理过程，包括DNA复制[13]、细胞周期控制[14]、[18]、铁死亡[19]和铜死亡[20]。在胃癌中，靶向FOXA1/CLDN4轴已被证明可以调节PI3K/AKT通路，从而抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移[21]。此外，研究表明生长因子受体如VEGFR2和FGFR1可以被VEGF-A和bFGF激活，驱动增殖和分化[22]，而与细胞死亡相关的转录特征被认为是胃癌腺癌的重要预后标志物[23]。然而，尽管PRIM2在其他癌症中的作用已被证实，但其在胃癌进展中的具体功能、机制贡献和下游通路仍大部分未明确，这代表了重要的知识空白。

RNA测序（RNA-seq）已成为一种强大的转录组工具，用于高分辨率分析基因表达，能够系统地发现癌症研究中的差异表达基因（DEGs）和通路失调。通过捕获整个转录组中的编码和非编码RNA，RNA-seq提供了比传统微阵列更高的灵敏度和动态范围，有助于识别与肿瘤发生和治疗反应相关的新分子特征[24]。在本研究中，我们使用RNA-seq分析了PRIM2敲低后GC细胞的转录图谱，以揭示其在细胞增殖和凋亡中的调节作用。

基于PRIM2在DNA复制和细胞周期调节中的作用，我们假设PRIM2通过增强增殖和抑制凋亡来促进GC进展，可能通过MCM7/CDK4通路和Bax/Bcl-2轴实现。本研究的主要目的是实验验证PRIM2在GC细胞生长和存活中的功能作用，并确定其关键的下游调节机制。这些发现为将PRIM2作为GC的潜在治疗策略提供了机制基础。

部分摘要（中文翻译）

胃癌（GC）中PRIM2的表达及其与患者预后的相关性分析

使用来自阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户（UALCAN；https://ualcan.path.uab.edu/）的癌症基因组图谱（TCGA）数据分析了GC组织和正常组织之间PRIM2的差异表达。使用Kaplan-Meier绘图平台（https://kmplot.com/）和基因表达微阵列数据进行了生存分析。基于PRIM2绘制了5年无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的预后模型

PRIM2在GC组织和细胞中高表达，并与患者预后呈正相关

为了探讨GC组织中的PRIM2表达情况，在TCGA数据库中的34个正常组织样本和415个GC组织样本中分析了PRIM2的表达水平，可通过UALCAN数据库访问

结果显示，GC组织中的PRIM2蛋白表达水平高于正常组织（P = 1.62e-12，图1A）。

为了明确PRIM2过表达的临床价值，我们使用KM绘图数据库中的基因芯片数据集分析了胃癌（GC）的5年生存结果

讨论

本研究表明，PRIM2在胃癌（GC）组织和细胞系中高表达，其表达水平升高与患者预后较差显著相关。功能实验证实PRIM2调节GC细胞的增殖和凋亡。转录组测序确定了MCM7/CDK4和Bax/Bcl-2通路是PRIM2的关键下游靶点，这一发现通过Western blot分析得到了进一步验证。体内研究使用裸鼠异种移植模型显示

结论

本研究揭示了PRIM2通过上调MCM7/CDK4信号通路促进胃癌细胞增殖的分子机制，敲低PRIM2显著抑制肿瘤生长。这一发现为胃癌的靶向治疗提供了新的方法，PRIM2有望成为精准干预的分子靶点。然而，本研究存在一些局限性，需要进一步探索临床样本验证和机制。

CRediT作者贡献声明

刘冰冰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学。王贤生：撰写 – 原始草稿，方法学，概念化。王月：验证，正式分析，概念化。张婷玉：方法学，数据管理。郭荣亮：资源，正式分析。陈晓丹：撰写 – 审稿与编辑，方法学。张志伟：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，正式分析，概念化。

知情同意声明

不适用。

机构审查委员会声明

该研究获得了河北医科大学第四医院实验动物福利伦理委员会的批准（批准编号：2024312）。

资助

本研究得到了河北省高等学校科学技术研究项目（QN2020234）、河北省自然科学基金的精准医学联合培养基金项目（H2021402007）以及邯郸市消化道癌症精准诊断和治疗重点实验室（23313014021）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢Xueshuai Ye的技术支持。