综述：通过体外实验和类器官研究揭示了YAP1变异体在眼裂畸形中的组织特异性机制

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Domain-specific mechanisms of YAP1 variants in ocular coloboma revealed by in-vitro and organoid studies

　　斯里希蒂·西尔瓦诺（Srishti Silvano）| 范·安妮卡·里克-伦泽（Van Annika Rick-Lenze）| 詹姆斯·巴格纳尔（James Bagnall）| 米拉利尼尼·萨拉瓦纳库马尔（Mrinalini Saravanakumar）| 杨欣宇（Xinyu Yang）| 罗伯特·利（Robert Lea）| 林赛·伯查尔（Lindsay Birchall）| 朱莉·R·琼斯（Julie R. Jones）| 杰西卡·M·戴维斯（Jessica M. Davis）| 雅各布·桑普森（Jacob Sampson）| 米莱娜·齐特尼克-塞尔吉ant（Milena Zitnik-Sergeant）| 安齐·米勒（Anzy Miller）| 雷切尔·E·詹宁斯（Rachel E. Jennings）| 埃利奥特·斯托尔曼（Elliot Stolerman）| 杰米·M·埃林福德（Jamie M. Ellingford）| 西蒙·C·洛维尔（Simon C. Lovell）| 福布斯·曼森（Forbes Manson）| 加文·阿诺（Gavin Arno）| 帕纳吉奥蒂斯·I·塞尔古尼奥蒂斯（Panagiotis I. Sergouniotis）| 塞里斯·S·曼宁（Cerys S. Manning）

曼彻斯特大学生物学、医学与健康学院医学科学系发育生物学与医学分会，英国曼彻斯特，M13 9PT

**摘要**

保守的转录共激活因子YAP1是器官发育和组织稳态的核心调节因子，它整合机械和生化信号来控制细胞增殖和存活。YAP1的变异体与一系列先天性疾病有关，包括具有或不具有综合征特征的常染色体显性眼裂孔。尽管具有这种临床意义，但YAP1在人类眼睛发育中的功能作用以及疾病相关错义变异的影响仍知之甚少。我们展示了人类胚胎中视裂处的YAP1表达情况，视裂是眼裂孔发病机制中的一个关键结构。通过计算机预测、基于细胞的检测方法以及荧光交叉相关光谱（FCCS）直接量化YAP1-TEAD结合，我们证明了YAP1错义变异的位置决定了其功能变化。TEAD结合域突变在荧光素酶检测中最显著地破坏了转录活性，而所有测试的变异体都抑制了内源性YAP1-TEAD靶基因的诱导。此外，在视网膜类器官中模拟YAP1-TEAD结合减少的效果导致前体细胞增殖和存活率下降。这些发现确立了YAP1依赖性转录缺陷作为驱动先天性眼畸形的机制，并为解释人类YAP1变异的致病性提供了框架。更广泛地说，这些发现强调了将遗传变异与疾病联系起来的功能分析的必要性。

**1. 引言**

眼裂孔是一种罕见的先天性眼畸形，估计发病率为每5000个新生儿中有1例[1]。它通常会导致严重的视力障碍，使患者的生活变得困难，并导致约10%的儿童失明[2]。眼裂孔是由于胚胎发育期间视裂闭合不完全造成的，导致虹膜、脉络膜、视网膜或视神经等眼部结构出现缺口。此外，眼裂孔常与其他组织融合缺陷（如唇裂和/或腭裂（CL/P）同时发生[3],[4]。眼裂孔已与40多个参与眼睛发育的基因的致病性变异相关联[5],[6]。YAP1（Yes相关蛋白1）是Hippo信号通路中的转录共激活因子，在动物模型中对眼睛发育起着关键作用[7],[8]，而YAP1的变异体与人类的常染色体显性眼裂孔有关[4],[9],[10],[11]。YAP1调节胚胎发育过程中的关键过程，如细胞增殖、分化和存活，并且还被证明是上皮-间充质转化（EMT）的调节因子[9],[12],[13]。其亚细胞定位通过磷酸化动态调节，主要通过Hippo激酶级联反应[14],[15],[16]。当Hippo通路激酶LATS1/2被激活时，它们会与YAP1的WW结构域结合并磷酸化保守的N端丝氨酸残基，特别是Ser127[17]。这种磷酸化会触发14-3-3蛋白的结合，将YAP1隔离在细胞质中并促进其降解[18]。相反，当LATS1/2失活时，YAP1会在细胞核中积累，并通过其TEAD结合域与转录因子TEAD1-4结合。这上调了CTGF、AXL、CYR61以及Bcl2和AIP家族的抗凋亡因子等关键靶基因[15],[16],[19]。YAP1的定位还受到基质硬度、细胞面积和细胞密度等物理因素的调节[20]。这部分是通过与α/β-连环蛋白和血管运动蛋白（AMOT）家族蛋白等膜相关蛋白的相互作用来实现的，这些蛋白可以促进YAP1在紧密连接处的定位[20]。这些调节机制确保YAP1整合生化和生物力学信号以控制细胞命运。

YAP1在眼睛发育中起着至关重要的作用，调节视杯形态发生、视网膜色素上皮（RPE）分化和视网膜前体细胞的扩增。在斑马鱼中，Yap1及其密切相关的转录因子Taz的缺失会导致眼裂孔和RPE的完全缺失[7]。此外，在小鼠中，条件性敲除YAP1会导致更严重的眼裂孔和小眼畸形表型。在发育中的视泡中，观察到色素丧失，类似于斑马鱼的情况，以及假定的RPE细胞向神经视网膜的转分化[8]。此外，YAP1缺陷的视网膜前体细胞表现出顶端细胞连接紊乱、增殖减少和细胞死亡增加[8]。迄今为止，YAP1在人类视网膜类器官（ROs）中的作用尚未得到系统研究，这为阐明其在早期人类视网膜发育中的功能提供了机会，补充了动物模型的发现。

遗传学研究在多个眼裂孔患者中发现了杂合YAP1变异体。这些变异体通常表现出不完全的外显率，一些携带者没有眼部缺陷，且表达程度各异，这意味着受影响个体的严重程度和相关特征可能差异很大。Williamson等人在一个家族中发现了共分离的杂合无义突变，另一个家族则同时具有眼裂孔和其他眼部异常[4]。DeYoung等人报告了一例具有双侧眼裂孔和小眼畸形的患者的YAP1移码变异[21]。Holt等人报告了一例从未受影响的父亲那里遗传的杂合单碱基对缺失的病例[11]。同样，Oatts等人报告了两例患有眼裂孔的母系同父异母兄弟中的杂合错义YAP1变异[10]。其他与疾病相关的YAP1变异也已存入ClinVar等临床数据库。YAP1变异在眼裂孔中的可变外显率使得确定某个特定变异是否真正致病变得复杂。值得注意的是，尽管最近在计算机预测工具方面取得了进展，但评估错义变异的致病性仍然特别具有挑战性。这类变异可以通过多种机制破坏蛋白质功能，包括改变折叠结构、降低稳定性、异常的亚细胞定位或受损的生化活性。因此，功能测试对于提高错义变异分类的准确性至关重要。

在这里，我们在细胞培养检测中测试了一组与眼裂孔相关的错义YAP1变异体，并在早期YAP1视网膜类器官中模拟了最严重的TEAD结合域变异体。我们发现，抑制类器官中的YAP1-TEAD结合显著影响了视网膜前体细胞的增殖和存活。此外，我们还发现TEAD结合域的变异对YAP1的转录活性影响最为显著。这些发现突显了YAP1-TEAD相互作用在人类视网膜发育中的关键作用，为理解疾病相关YAP1变异的致病性提供了框架。

**2. 材料与方法**

**2.1. 变异体选择**

研究的变异体是通过在Clinvar中进行“YAP1”搜索（访问日期：2023年3月1日）并筛选出错义变化后选定的，进一步选择了具有眼部异常的个体的变异体。此外，还包括一个已发表的与眼裂孔相关的YAP1错义变异体（表1）[10]。

**2.2. 患者变异体鉴定**

使用Agilent SureSelectXT Clinical Research Exome（Human V5）试剂盒，针对已知与疾病相关的基因组外显子区域（编码序列和已知蛋白质编码基因的剪接接合处）进行测序，使用提交的样本中的基因组DNA。测序在Illumina NextSeq500仪器上进行。使用NextGENe?软件和内部生物信息学流程，将DNA序列与人类基因组构建19（hg19/NCBI构建37）对齐和比较。Cartagenia Bench Lab NGS软件（现称为Alissa Interpret）用于过滤和分析患者中识别的序列变异。报告的变异体通过Sanger测序在患者及其母亲身上得到了确认。

**2.3. YAP1变异体的计算致病性预测和蛋白质建模**

使用了一组计算机预测工具对YAP1变异体进行分类，包括：CADD [22]、REVEL [23]、SIFT [24]、Mutation Taster [25]、AlphaMissense [26]。还使用了蛋白质保守性评分进行变异体分类。这些评分可在dbNSFP、ProtVar UI V1.3和VarSome [27],[28],[29]中获得。

为了可视化所研究遗传变异的影响，我们使用了从Protein Databank（PDB）[30],[31]中提取的YAP1结构模型3KYS（YAP1-TEAD复合物）和5YDY（YAP1-LATS复合物）。使用“Reduce”软件[32]添加了氢原子，并使用Probe [33]可视化了变异氨基酸与蛋白质其余部分之间的相互作用。在每种情况下，侧链构象都使用能提供最有利相互作用的旋转器进行建模[34]。

**2.4. YAP1定点突变**

质粒pLL3.7-EF-EYFP-YAP1_WT-PolyA（Addgene，#112284）（以下简称EYFP-YAP1-WT）和pLL3.7-EF-EYFP-YAP1_S94A-PolyA（Addgene，#112286）（YAP1 p.Ser94Ala）由Erik Sahai赠送[35]。以下YAP1变异体p.Val55Leu（c.163G > T）、p.Met86Thr（c.257 T > C）、p.Phe95Ser（c.284 T > C）、p.Ser127Ala（c.379 T > G）、p.Lys254Arg（c.761A > G）、p.Ser257Phe（c.770C > T）、p.Glu356Asp（c.1068G > T）通过Q5?定点突变试剂盒（New England Biolabs，#E0554）引入野生型质粒EYFP-YAP1-WT中。所有质粒均通过Sanger测序（Eurofins Scientific）和全质粒Nanopore测序（Source BioScience）进行了序列验证。

**2.5. 细胞培养和荧光素酶检测**

HEK293 LTV细胞系（Cell Biolabs，#LTV-100）在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco，#10500064）和1%青霉素/链霉素（Merck Life Sciences，#P4333）的DMEM高糖培养基（Sigma-Aldrich，#D6429）中维持。对于TEAD依赖的荧光素酶检测，将70–80%汇合度的HEK293 LTV细胞接种在涂有10 μg/ml纤维连接蛋白（Sigma-Aldrich，#341635）的12孔板（Corning，#3513）上，每孔60,000个细胞，培养48小时。然后使用Lipofectamine? 3000转染试剂盒（Invitrogen，#L3000-008）将100 ng 8xGTIIC-luciferase（Addgene，#34615）和50 ng pRL-CMV-Renilla荧光素酶对照载体（Promega，#E2261）以及150 ng EYFP-YAP1构建物（野生型，p.Val55Leu，p.Met86Thr，p.Ser94Ala，p.Phe95Ser，p.Ser127Ala，p.Lys254Arg，p.Ser257Phe，p.Glu356Asp）转染到细胞中，重复三次。细胞培养24小时后，用200 μl 1×被动裂解缓冲液（Promega，#E1941）裂解；将20 μl裂解液转移到与Luminometer兼容的Nunc?微孔白色聚苯乙烯96孔板（Thermofisher Scientific，#236105）上，使用Dual-Glo荧光素酶检测系统（Promega，#E2920）进行荧光素酶检测。荧光素酶发光强度用GloMax? navigator微孔发光计（Promega，#GM2010）进行标准化。每个变异体重复检测三次。

**2.6. 慢病毒制备和转导**

当HEK293 LTV细胞达到70%汇合度时，将EYFP-YAP1野生型和变异型质粒转染到10 cm细胞培养板中，遵循慢病毒安全协议。简要来说，将1×聚乙烯亚胺（PEI STAR?；R&D systems，#7854）与DMEM混合并在室温下孵育2分钟。在另一个试管中，将DMEM与第二代HSV-G包膜质粒MD2.G（6 μg）（Addgene，#12259）和包装载体质粒psPax2（8 μg）（Addgene，#12260）混合，并在室温下孵育2分钟。然后将两种溶液混合（vector-PEI），并在室温下孵育30分钟。用一半体积的常规培养基替换HEK293 LTV细胞培养基，并逐滴加入vector-PEI溶液，在37°C下孵育过夜；第二天，用含有1 M丁酸钠（100 μl在10 ml细胞培养基中）的完整培养基替换细胞培养基并孵育6小时。随后用新鲜的完整培养基替换细胞培养基并孵育2夜。然后通过0.45 μm注射器过滤器（Starlab，#E4780-1453）过滤细胞培养基，并用1×聚乙二醇（PEG-it?；SBI System Biosciences，#LV810A-1）在4°C下浓缩病毒4天。浓缩的病毒上清液用于转染HEK293 LTV细胞48小时，随后通过FACS分选以富集EYFP阳性细胞。

**2.7. 蛋白质分离和Western印迹**

用Pierce RIPA裂解缓冲液（Thermofisher Scientific，#89900）和蛋白酶抑制剂（Roche，#11836170001）裂解转染了EYFP-YAP1构建物的HEK293 LTV细胞。将细胞裂解液的上清液与NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen，#NP0007）和NuPAGE样品还原剂（Invitrogen，#NP0004）混合，在95°C下孵育5分钟。蛋白质样品加载到Mini-PROTEAN TGX无染凝胶（Bio-Rad，#4568125）中，使用trisglycine/SDS缓冲液（BioRad，#1610772）进行电泳，电泳电压为100 V，持续1.5小时。蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜（BioRad，#1704158）上，使用TransBlot turbo转移系统。印迹用5%牛奶在1× Tris缓冲盐水（BioRad，#1706435）- Tween 20（Sigma Life Science，#P9416）中封闭。使用的抗体包括兔抗YAP（D8H1X）（1:1000；Cell Signaling，#14074）、鼠抗β-actin（1:1000；Sigma-Aldrich，#A1978）、抗鼠IgG HRP连接物（1:2000；Cell Signaling，#7076）和抗兔IgG HRP连接物（1:2000；Cell Signaling，#7074）。印迹在ChemiDoc MP成像系统（BioRad）中使用Pierce? ECL western blotting底物（Thermofisher Scientific，#32209）进行可视化。

**2.8. 荧光交叉相关光谱（FCCS）**

使用ZEN 2.1软件在Zeiss LSM 880上进行FCCS，该仪器配备有安装在舞台上的孵育器，以在湿润的5% CO2环境中保持细胞温度为37°C。对于FCCS实验，使用FACS分选的HEK293 LTV细胞（携带EYFP-YAP1野生型和变异型构建体）以每孔60,000个细胞的密度接种在涂有纤维连接蛋白（10 μg/ml）的12孔板上。随后，这些细胞被转染150 ng或225 ng的TEAD1-mscarlet-I质粒，持续48小时。之后，细胞以每孔35,000个细胞的密度接种在涂有纤维连接蛋白的4腔玻璃底板上（Greiner bio-one，#627870），再持续48小时，之后在更换培养基后进行FCCS成像。FCCS测量方法如先前报道[36]所述。简而言之，使用Zeiss倒置LSM880共聚焦显微镜进行测量，该显微镜配备40×1.3 N.A.油浸物镜，针孔设置为1 airy单位。荧光蛋白EYFP和mScarlet-I分别用488 nm和561 nm激光线激发。在保持信号的同时，注意使用适当的功率以减少漂白现象。FCCS测量是在每个细胞核中进行的，每次测量时间为10秒，重复1次，收集体积为1 airy单位，以获得最大信号强度。数据使用先前报道的python脚本进行分析，该脚本用于拟合Zen采集软件生成的相关曲线[37]。

2.9. YAP1变异体在细胞核与细胞质中的定位比率荧光成像
携带EYFP-YAP1野生型和变异型构建体的HEK293 LTV细胞以每孔45,000个细胞的密度接种在涂有纤维连接蛋白（10 μg/ml）的4腔玻璃底板上，持续48小时。然后，这些细胞被固定并用DAPI（Sigma Aldrich，#D9542）复染，使用Zeiss LSM880进行成像。荧光强度使用FIJI软件测量。为每个细胞选择细胞核和细胞质的ROI（感兴趣区域），并使用细胞区域外的荧光强度进行背景校正。

2.10. 人类iPSCs的维持和分化为视网膜类器官
人类诱导多能干细胞（hiPSC）野生型AD4系来自英国纽卡斯尔大学的Majlinda Lako。细胞在涂有Vitronectin（Thermofisher Scientific，#A14700）的培养皿中生长，并在StemFlex?（Thermofisher Scientific，#A3349401）培养基中于37°C和5% CO2条件下维持。当细胞密度超过70%时，使用1:6的比例在StemFlex?中传代，并加入10 μM的Y-27632 ROCK抑制剂（ROCKi；Sigma，#Y0503）和0.5 mM的EDTA。根据Chichagova等人的方法生成ROs（原始细胞群），并进行了一些修改[38]。在第-2天，使用accutase（Sigma，#A6964）将hiPSCs解离成单个细胞，并以每孔7000个细胞的密度接种在96孔Nunclon Sphera-Treated U-bottom板上（Thermofisher Scientific，#174925），同时加入10 μM的ROCKi。两天后，将StemFlex?替换为200 μl的分化培养基，并每两天更新一次。分化培养基包含41%的Iscove's改良Dulbecco's培养基（Gibco，#12440-046）、41%的Hams F-12（Gibco，#11765-047）、15%的KnockOut血清替代物（Gibco，#10828010）、1%的GlutaMax（Gibco，#35050061）、1%的化学定义脂质浓缩物（Gibco，#11905031）和225 μM的1-硫甘油（Sigma，#88640）。在第6天，分化培养基中加入50 ng/ml的BMP4（R&D Systems，#314-BP-010）。之后每三天更新一次培养基。在分化第18天，培养基替换为含有DMEM/F-12（Thermofisher，#31330095）、5% FBS、1% N2补充剂（Thermofisher Scientific，#17502048）、0.1 mM牛磺酸（Sigma，#T8691）、0.25 μM视黄酸（Sigma，#R2625）和0.25 μg/ml Fungizone（Gibco，#15290018）的维持培养基。培养基每周更新三次。对于verteporfin处理，第35天对ROs进行7天的0.25 μM verteprofin处理；对于对照组，则使用等体积的DMSO处理。对于Selinexor（SLX）处理，第35天对ROs进行24小时的1 μM SLX处理；对于对照组，则使用等体积的DMSO处理。

2.11. 视网膜类器官和人类胚胎组织的免疫染色
ROs收集后在4%的甲醛中摇动20分钟进行固定，然后在4°C下用30%的蔗糖浸泡过夜。随后将ROs嵌入OCT Embedding Matrix（Pioneer Research Chemicals Ltd）模具中，并在-80°C下冷冻。使用Leica CM3050 S冷冻切片机将冷冻切片切成12 μm厚度。

人类胚胎材料是在获得西北研究伦理委员会（23/NW/0039）的伦理批准以及英国人类组织管理局发布的实践准则和2008年人类组织法案的立法许可下，从医疗和手术终止妊娠中获得的。在处理和石蜡包埋之前，样本在4%的甲醛中固定1小时。切片间隔为5 μm，每第八个切片进行苏木精和伊红染色以确认形态和解剖标志。选择含有CS15–16阶段眼部组织的切片进行免疫染色。切片在二甲苯和乙醇中重新水化，然后为了抗原回收，在1×柠檬酸钠中煮沸10分钟，之后从热源中取出。

在ROs上使用的初级抗体包括小鼠抗-VSX2（Santa Cruz Biotechnology，#sc-365519）、兔抗-YAP1（D8H1X；1:200；Cell Signaling，#14074）、小鼠抗-磷酸化组蛋白H3（1:200；Abcam，#Ab14955）和兔抗-cleaved Caspase3（1:100；Cell Signaling，#9661）；在人类组织上使用的抗体包括小鼠抗-YAP（63.7；1:100；Santa Cruz Biotechnology，#sc-101199）和兔抗-p-YAP（Ser127；1:1600；Cell Signaling，#D9W2I）。使用的二级抗体包括驴抗兔488（1:800；Invitrogen，#A21206）和驴抗鼠594（1:800；Invitrogen，#A21203）。ROs用DAPI复染，用phalloidin突出显示皮质肌动蛋白。人类胚胎组织脱水后，使用含有DAPI的Vectashield抗褪色 mounting medium（Vector Laboratories，#H1200）进行封装。

2.12. 视网膜类器官的RNAseq和分析
在每个时间点，收集八个ROs，并使用QiAGEN? RNeasy Micro Kit按照制造商的协议（Qiagen，#74104）进行总RNA提取。使用4200 TapeStation（Agilent Technologies）和Qubit（Thermofisher Scientific）评估RNA样本的质量和完整性。根据曼彻斯特大学Genomic Technologies Core Facility的制造商协议，使用Illumina? Stranded mRNA Prep. Ligation kit生成测序文库。然后在Illumina NovaSeq6000仪器上进行配对末端测序（2×75 bp）。输出数据使用Illumina的bcl2fastq软件（版本2.20.0）进行去多路复用和BCL-to-Fastq转换。遵循GTEx Consortium（2019）的Genotype-Tissue Expression（GTEx）分析流程进行读段质量控制、比对和表达量化[39]。简而言之，使用STAR v2.7.4a [40]对人类参考基因组GRCh38进行比对。使用GENCODE v38注释进行基因水平表达量化[41]。使用RSEM v1.3.0进行转录本水平量化（以每百万转录本计，TPM）[42]。本研究生成的RNA-seq数据已存入Gene Expression Omnibus（GEO），访问号为GSE326554。

2.13. 单细胞RNAseq分析
分析了已发表的人类胎儿神经视网膜和视网膜色素上皮数据集中的单细胞RNA-seq TPM数据[43]，样本限制在妊娠后第5-7周。为了质量控制，在Seurat中进行下游分析之前，排除了检测到的基因少于500个或线粒体转录本含量超过25%的细胞。选择了2000个高变异性基因进行PCA分析，并使用Seurat FindNeighbors函数构建了前12个主成分的共享最近邻图。使用Louvain算法以0.4的分辨率对细胞进行聚类，使用相同的 principal components进行UMAP二维可视化。根据Seurat（FindAllMarkers）识别的标记基因对簇进行细胞类型注释，并与已发表的早期视网膜和RPE发育的标记进行比较。

2.14. 统计分析
统计分析在GraphPad Prism 9.3.1中进行。在选择适当的测试之前，使用Shapiro-Wilk方法检测数据的正态性。显著性定义如下：ns p > 0.05，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，???p < 0.0001。在亚细胞定位分析中使用ROUT去除异常值。

3. 结果
3.1. YAP1在人类视网膜前体细胞和RPE中表达
鉴于裂孔症源于视神经裂隙闭合缺陷，我们分析了相关发育阶段（CS15–16）人类胚胎眼组织中的YAP1表达。我们发现YAP1在整个假定的神经视网膜和RPE中都有表达。在视网膜的顶端表面和神经视网膜与RPE之间的铰链区域有富集（图1A）。在发育中的神经视网膜中，YAP1主要表现为细胞质定位。这得到了磷酸化YAP1（phospho-YAP1）的存在支持，这是细胞质YAP1隔离和活跃Hippo信号传导的标志（图1A）。相比之下，眼周间充质中的总YAP1水平相对于phospho-YAP1较高，表明该区域有更多活跃的、核定位的YAP1。同时，发育中的晶状体组织表现出更多的细胞质/转录不活跃的phospho-YAP1（图1A）。

此外，我们分析了公开可用的人类胚胎scRNA-seq数据集（PCW5-7）[43]，以分析YAP1同源物WWTR1（TAZ）和YAP1结合伙伴TEAD1-4的细胞表达（图1C和图S1）。WWTR1的表达与YAP1一致。在TEADs中，TEAD1在眼部细胞类型中表达最广泛且最高，尽管TEAD3也在早期RPE和眼周间充质中表达。然后，我们分析了YAP1在发育中的眼睛中的选择性下游靶标，以确认YAP1的活跃转录作用（图1D和图S1）。典型的靶标CTGF、CYR61、AMOTL2和AXL在视网膜前体细胞、RPE和眼周间充质中表达，与染色的人类胚胎组织中观察到的YAP1表达模式一致。这确立了YAP1在眼睛发育中的重要性。

3.1.1. 四种YAP1异构体在人类视网膜类器官中的表达
接下来，我们研究了早期hiPSC衍生的ROs（第35天）中VSX2+视网膜前体细胞中的YAP1表达（图1B）。在这些细胞中，YAP1主要位于细胞质中，与人类胚胎相似。在RNA水平上，YAP1的交替剪接产生了8种mRNA异构体。YAP1异构体之间的主要区别在于是否存在第二个WW结构域，以及转录激活域（TAD）内的额外序列差异。对ROs的RNA-seq数据分析显示，表达了四种主要的YAP1异构体：YAP1–201（全长典型异构体，最丰富，产生YAP1–2γ蛋白）、YAP1–202（缺少WW2结构域，产生YAP1–1δ蛋白）、YAP1–208（TAD较短，产生YAP1–2α蛋白）和YAP1–209（TAD内含有额外序列，产生YAP1–2β蛋白）（图1E）。

3.2. YAP1变异体的选择和计算机建模
为了深入了解YAP1的结构和功能，我们研究了五种ClinVar注释的YAP1变异体以及一个先前未报告的变异（c.1068G > T, p.Glu356Asp）（表1）。后者是通过一名患有裂孔症、腭裂、牙槽嵴裂和发育迟缓的患者的临床外显子测序发现的（表1，图2A）。临床评估无法确认p.Glu356Asp变异体的致病性，因此被归类为意义不明确的变异（VUS）。这一分类得到了患者未受影响的母亲和gnomAD v4数据集中的13个等位基因的支持。值得注意的是，Glu356残基在斑马鱼、鸡、小鼠和人类中是保守的，该变异是从谷氨酸到另一种酸性侧链天冬氨酸的保守变化。

表1. 本研究选定的YAP1变异体
蛋白质变化 mRNA变化 SNP ID gnomAD变异体 ID gnomAD频率 YAP1结构域 受影响的异构体 临床表型 ClinVar解释 参考文献
Valine 55 Leucine (p.Val55Leu) c.163G > Trs119086747 311–102111011-G-T1/1599450 TEAD结合位点全部 Uveal coloboma-cleft lip and palate-intellectual disability (COB1) VUS
Methionine 86 Threonine (p.Met86Thr) c.257 T > Crs213508677 8–– TEAD结合位点全部 COB1 Pathogenic
Phenylalanine 95 Serine (p.Phe95Ser) c.284 T > C––– TEAD结合位点全部 Coloboma N/A Oatts等人 [10]
Lysine 254 Arginine (p.Lys254Arg) c.761A > Grs194793046 0–– WW2结构域 YAP1–2α(208), YAP1–2β(209), COB1 VUS
ClinVar Serine 257 Phenylalanine (p.Ser257Phe) c.770C > Trs194793141 5–– WW2结构域 YAP1–2α(208), YAP1–2β(209), COB1 VUS
ClinVar Glutamic acid 356 Aspartic acid (p.Glu356Asp) c.1068G > Trs195005907 811–102223657-G-T13/1614156 转录激活域全部 Coloboma, cleft lip and alveolar ridge, developmental delay N/A Novel variant COB1: uveal coloboma-cleft lip and palate-intellectual disability; VUS: variant of unknown significance.

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图1. 早期人类眼睛发育过程中的YAP1表达。(A) 人类胚胎眼组织（CS15–16）中phospho-YAP1 (P-YAP1(Ser127))和YAP1的表达 [比例：50 μm]。(B) 第35天视网膜类器官中YAP1与VSX2+视网膜前体细胞的共定位 [比例：40 μm]。点图显示(C) YAP1、WWTR1 (YAP1同源物) 和 TEAD1–4 (YAP1相互作用伙伴) 以及(D) 从人类胚胎PCW5–7的scRNAseq簇中选定的YAP1靶基因的相对表达。点大小代表每个基因表达的细胞百分比，颜色表示每个簇内的平均对数转换TPM表达。(E) iPSCs和视网膜类器官分化过程中4/8种YAP1异构体的水平。pR: 眼周间充质。pR: 假定视网膜。pRPE: 假定视网膜色素上皮。OF: 视神经裂隙。iPSC: 诱导多能干细胞。
此外，我们还分析了公开可用的人类胚胎scRNA-seq数据集（PCW5-7）[43]，以分析YAP1同源物WWTR1（TAZ）和YAP1结合伙伴TEAD1-4的细胞表达（图1C和图S1）。WWTR1的表达与YAP1一致。在TEADs中，TEAD1在眼部细胞类型中表达最广泛且最高，尽管TEAD3也在早期RPE和眼周间充质中表达。然后，我们分析了YAP1在发育中的眼睛中的选择性下游靶标，以确认YAP1的活跃转录作用（图1D和图S1）。典型的靶标CTGF、CYR61、AMOTL2和AXL在视网膜前体细胞、RPE和眼周间充质中表达，与染色的人类胚胎组织中观察到的YAP1表达模式一致。这确立了YAP1在眼睛发育中的重要性。

3.1.1. 四种YAP1异构体在人类视网膜类器官中的表达
接下来，我们研究了早期hiPSC衍生的ROs（第35天）中VSX2+视网膜前体细胞中的YAP1表达（图1B）。在这些细胞中，YAP1主要位于细胞质中，与人类胚胎相似。在RNA水平上，YAP1的交替剪接产生了8种mRNA异构体。YAP1异构体之间的主要区别在于是否存在第二个WW结构域，以及转录激活域（TAD）内的额外序列差异。对ROs的RNA-seq数据分析显示，表达了四种主要的YAP1异构体：YAP1–201（全长典型异构体，最丰富，产生YAP1–2γ蛋白）、YAP1–202（缺少WW2结构域，产生YAP1–1δ蛋白）、YAP1–208（TAD较短，产生YAP1–2α蛋白）和YAP1–209（TAD内含有额外序列，产生YAP1–2β蛋白）（图1E）。

3.2. YAP1变异体的选择和计算机建模
为了深入了解YAP1的结构和功能，我们研究了五种ClinVar注释的YAP1变异体以及一个先前未报告的变异（c.1068G > T, p.Glu356Asp）（表1）。后者是通过一名患有裂孔症、腭裂、牙槽嵴裂和发育迟缓的患者的临床外显子测序发现的（表1，图2A）。临床评估无法确认p.Glu356Asp变异体的致病性，因此被归类为意义不明确的变异（VUS）。这一分类得到了患者未受影响的母亲和gnomAD v4数据集中的13个等位基因的支持。值得注意的是，Glu356残基在斑马鱼、鸡、小鼠和人类中是保守的，该变异是从谷氨酸到另一种酸性侧链天冬氨酸的保守变化。

表1. 本研究选定的YAP1变异体
蛋白质变化 mRNA变化 SNP ID gnomAD变异体 ID gnomAD频率 YAP1结构域 受影响的异构体 临床表型 ClinVar解释 参考文献
Valine 55 Leucine (p.Val55Leu) c.163G > Trs119086747 311–102111011-G-T1/1599450 TEAD结合位点全部 Uveal coloboma-cleft lip and palate-intellectual disability (COB1) VUS
ClinVar Methionine 86 Threonine (p.Met86Thr) c.257 T > Crs213508677 8–– TEAD结合位点全部 COB1 Pathogenic
ClinVar Phenylalanine 95 Serine (p.Phe95Ser) c.284 T > C––– TEAD结合位点全部 Coloboma N/A Oatts等人 [10]
Lysine 254 Arginine (p.Lys254Arg) c.761A > Grs194793046 0–– WW2结构域 YAP1–2α(208), YAP1–2β(209), COB1 VUS
ClinVar Serine 257 Phenylalanine (p.Ser257Phe) c.770C > Trs194793141 5–– WW2结构域 YAP1–2α(208), YAP1–2β(209), COB1 VUS
ClinVar Glutamic acid 356 Aspartic acid (p.Glu356Asp) c.1068G > Trs195005907 811–102223657-G-T13/1614156 转录激活域全部 Coloboma, cleft lip and alveolar ridge, developmental delay N/A Novel variant COB1: uveal coloboma-cleft lip and palate-intellectual disability; VUS: variant of unknown significance.

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图2. YAP1变异体对蛋白质结构的影响建模。(A) YAP1 p.Glu356Asp的系谱。(B) 本研究中的YAP1变异体在不同蛋白质结构中的位置。(C-G) 在解决蛋白质结构中引入YAP1变异体。(C-E) YAP1-TEAD复合体：p.Val55Leu, p.Met86Thr, p.Phe95Ser。(F-G) YAP1-LATS: p.Lys254Arg, p.Ser257Phe.绿色和蓝色点代表有利的范德华相互作用，黄色和粉色尖峰代表不利的原子重叠。（H）Western blot显示HEK293细胞中未降解的YAP1变异蛋白。（关于此图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网络版本。）研究的变异分布在YAP1的结构域中：p.Val55Leu、p.Met86Thr和p.Phe95Ser位于TEAD结合域内；p.Lys254Arg和p.Ser257Phe位于WW2域；p.Glu356Asp位于TAD域（图2B）。使用当前的变异效应预测器，不同算法得出的致病性评分有所不同。然而，p.Phe95Ser和p.Ser257Phe被一致预测为致病性（表2）。表2. YAP1致病性预测评分的比较。蛋白质变化致病性评分保守性评分REVEL评分CADDSIFTAlpha Missense GRCh38PolyPhen2Mutation TasterMutation AssessorPhyloP100p.Val55Leu0.035很可能有害可容忍致病性良性致病性致病性中等0.711p.Met86Thr0.141很可能有害有害致病性良性致病性中等2.122p.Phe95Ser0.189可能有害有害致病性可能有害致病性中等5.008p.Lys254Arg0.492很可能有害可容忍良性可能有害致病性中性9.321p.Ser257Phe0.927可能有害有害致病性可能有害致病性中等7.902p.Glu356Asp0.158潜在有害可容忍良性良性多态性中性0.82为了评估这六个研究变异如何影响YAP1的结构和关键结合界面，我们利用两种可用的YAP1蛋白结构在计算机上进行了建模（图2C-G）[30]，[31]。值得注意的是，YAP1-TEAD复合物有三个高度保守的界面（YAP1残基52–58、61–73和86–100）。p.Val55Leu变异位于第一个界面（残基52–58）内。这种氨基酸替换保持了疏水性，但较大的侧链增加了相互作用的数量，同时也引入了与邻近残基的范德华（vdW）碰撞，可能表明具有致病效应。第三个界面（残基86–100）似乎是最关键的；它高度疏水，YAP1的Met86、Leu91和Phe95的侧链与疏水的TEAD口袋结合并形成多个vdW相互作用[30]。之前对YAP1残基的丙氨酸扫描发现Met86、Arg89、Leu91、Ser94、Phe95和Phe96的突变导致活性完全丧失。此外，增加Met86和Phe95的疏水性增强了YAP1-TEAD的结合，突显了它们在YAP1中的关键作用[44]。根据本研究中的蛋白质建模，p.Met86Thr和p.Phe95Ser变异通过替换为极性残基来破坏疏水性，从而减弱了疏水界面，减少了vdW相互作用，在该位置形成了一个空腔，并可能降低了YAP1-TEAD的相互作用。关于YAP1 WW解决后的蛋白结构，YAP1的WW域与LATS的PPxY基序相互作用[31]。YAP1残基Lys254和Asn250相互作用形成疏水沟槽以适应LATS1的PPxY基序残基侧链。因此，预测p.Lys254Arg的变化会有影响，尽管其功能相关性无法仅通过建模来确认。对于p.Ser257Phe的变化，野生型丝氨酸参与分子内相互作用，有助于在YAP1中形成β-折叠片。用体积较大的疏水性苯丙氨酸替换这个小的极性残基可能会破坏局部相互作用。此外，它在蛋白质表面的位置可能导致由于疏水侧链的不利暴露而降低溶解度。需要注意的是，p.Glu356Asp变异的结构建模是不可行的，因为受影响的残基在任何实验确定的YAP1结构中都不存在，并且在AlphaFold模型中位于低置信度区域。3.3. YAP1变异不会导致蛋白质降解为了测试YAP1变异效应是否是由于蛋白质降解引起的，将研究的变异引入到典型的全长序列质粒（野生型EYFP-YAP1）中，并在HEK293 LTV细胞中过表达。Western blot显示野生型和突变蛋白的表达水平相似（图2H），表明YAP1变异不会诱导蛋白质降解。3.4. YAP1变异p.Met86Thr和p.Ser257Phe对亚细胞定位有不同的影响如上所述，类器官和人眼组织染色（图1A-B）显示YAP1在细胞核和细胞质中都有定位，其中不同的结合伙伴介导了特定区域的功能。我们假设YAP1中的错义变化可能会破坏这些相互作用，包括与其亚细胞定位调节因子（如LATS1/2）的相互作用。为了评估YAP1变异对亚细胞定位的影响，我们生成了表达EYFP标记的YAP1构建物的稳定HEK293 LTV细胞系，包括磷酸受体位点突变p.Ser127Ala作为阳性对照（已知会损害磷酸化，从而减少细胞质转定位）[45]，[46]，[47]。在同一细胞的细胞核和细胞质中测量EYFP的强度，以计算核与细胞质的定位比率。YAP1变异p.Val55Leu和p.Lys254Arg对YAP1的细胞定位没有显著影响。同样，尽管位于预测的核输出序列（残基340–357）[48]内，p.Glu356Asp也没有影响。TEAD结合域变异p.Met86Thr显示出核定位的显著下降，而p.Phe95Ser显示出非显著的下降（图3A-B，图S2）。而WW2域变异p.Ser257Phe显著增加了YAP1的核定位，p.Lys254Arg变异则没有（图3A-B，图S2）。这表明Ser257对于调节YAP1定位至关重要，可能是通过磷酸化或LATS1/2结合实现的，这与蛋白质建模和已知的两个WW域与LATS1/2的相互作用一致[31]。3.5. TEAD结合域中的YAP1变异影响荧光素酶测定中的转录活性YAP1的一个关键功能是通过TEAD结合和激活目标基因来实现的。为了评估研究的YAP1变异是否影响YAP1-TEAD依赖的转录，在HEK293 LTV细胞中过表达合成TEAD响应启动子进行了荧光素酶测定。阳性对照变异p.Ser94Ala（先前显示会减少YAP1-TEAD相互作用）[35]，[49]如预期地降低了荧光素酶活性。在其他TEAD结合域变异中，只有p.Phe95Ser显示出转录活性的显著下降，尽管p.Met86Thr也有向下降活动的趋势（图3C）。p.Val55Leu、p.Lys254Arg和p.Glu356Asp变异对TEAD依赖的荧光素酶活性没有影响（图3C）。尽管p.Ser257Phe在核中的定位较高，但它没有影响转录活性（图3B-C）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图3. YAP1变异影响蛋白质定位和转录活性。（A）EYFP-YAP1野生型（WT）、p.Met86Thr和p.Ser257Phe变异的亚细胞定位。[比例：50 μm]（B）相对于WT EYFP-YAP1，YAP1变异的相对核与细胞质定位的量化，实验对照为p.Ser127Ala。分析了来自3个生物学重复实验的>100个细胞。p值使用Kruskal-Wallis检验计算（N = 3，n ≥ 100）。数据以箱线图表示，显示第25至75百分位数，中位数用线表示（C）EYFP-YAP1 WT、变异体和对照p.Ser94Ala的TEAD依赖荧光素酶测定的倍数变化。p值使用普通单因素ANOVA和Dunnett的多重比较检验计算。N = 3。（D）EYFP-YAP1 WT、变异体和对照p.Ser94Ala的内源性CYR61和CTGF表达的倍数变化。p值使用普通单因素ANOVA和Dunnett的多重比较检验计算。N = 3。条形图表示平均值±标准差。统计显著性定义为：p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***），p < 0.0001（****）；ns = 不显著。3.6. 不同结构域中的YAP1变异下调内源性下游靶标为了评估研究的YAP1变异在生物学相关的染色质环境中的效应，我们比较了在HEK293 LTV细胞中过表达YAP1变异后内源性CTGF和CYR61的表达。与EYFP对照载体相比，野生型EYFP-YAP1过表达导致CTGF和CYR61表达的显著增强（图3D）。所有变异都显示出这两种基因表达大约减半，其中p.Glu356Asp的减少最为显著（图3D）。尽管只有p.Phe95Ser显著降低了TEAD依赖的荧光素酶活性，但所有变异都一致地降低了内源性靶基因的表达。一个可能的解释是TEAD响应报告质粒是外周的且高度可访问的。相比之下，内源性基因受到表观遗传调控，如组蛋白修饰和DNA甲基化，这可能会限制或增强转录因子的访问，可能绕过了关键的调控机制。此外，内源性基因可能需要YAP1-TEAD与多个因子的协同结合，例如染色质重塑复合体或长距离增强子相互作用，而这些在报告质粒中不存在[50]。这表明天然基因背景和染色质环境对于分析错义变异对转录调节因子的效应至关重要。3.7. TEAD结合域中的YAP1变异影响TEAD结合为了评估TEAD结合域中的变异观察到的转录活性下降是否是由于YAP1-TEAD结合减少引起的，我们使用FCCS测量了YAP1-TEAD蛋白-蛋白相互作用强度。FCCS是一种高灵敏度的共聚焦显微镜技术，可以测量两个荧光标记分子在活细胞中的同时扩散，以检测和量化分子相互作用（在这种情况下，细胞过表达EYFP-YAP1变异和TEAD1-mScarlet-I）。通过分析EYFP和mScarlet-I荧光信号的相关波动，FCCS提供了YAP1-TEAD1蛋白-蛋白结合亲和力的定量估计（图4A-C和图S3）。这表明野生型YAP1-TEAD1相互作用的平均解离常数（Kd）为283 ± 72 nM（平均值±标准差），表明结合亲和力适中（图4D和图S3(C)）。在研究的变异中，p.Met86Thr和p.Phe95Ser显示出显著增加的Kd（较弱的相互作用力），与对照p.Ser94Ala相似（图4D）。正如预期的那样，对于未与TEAD或DNA结合的YAP1，这些变异也表现出比野生型更高的扩散速率（图4E）。YAP1-TEAD1解离常数（结合亲和力的倒数）与荧光素酶活性呈负相关（图4F），表明YAP1和TEAD之间的物理相互作用对于荧光素酶测定中的下游基因激活是必要且限速的。3.8. 在视网膜类器官中抑制YAP1-TEAD结合可减少增殖并增加凋亡在HEK293 LTV细胞中对YAP1变异的功能测试显示，与coloboma相关的突变对YAP1-TEAD依赖的转录活性有负面影响，表明核内YAP1功能的破坏可能有助于coloboma的发病机制。然而，人视网膜组织的染色显示YAP1在细胞质中富集。接下来，我们使用早期ROs研究了YAP1是否也存在于细胞核中并在早期视网膜组织中进行活跃的核-细胞质穿梭。这些ROs再现了早期视网膜神经上皮及其细胞组成，使得能够研究蛋白质定位和调节视网膜祖细胞命运的机制。早期ROs用核输出抑制剂Selinexor（SLX）处理。对总YAP1蛋白的染色显示，在SLX条件下YAP1的核定位更加明显，表现为核:细胞质YAP1比率显著增加（图5A-B）。这种增加与SLX阻断XPO1介导的核输出一致，防止YAP1从细胞核中流出[51]。这表明YAP1在细胞核和细胞质之间动态穿梭，并且可能在视网膜祖细胞中具有调节转录的核作用。下载：下载高分辨率图像（886KB）下载：下载全尺寸图像图4. 通过荧光交叉相关光谱（FCCS）量化YAP1-TEAD1结合（A）FCCS原理示意图，用于测量细胞核中荧光标记的YAP1和TEAD1的扩散和蛋白-蛋白相互作用强度。（B）HEK293 LTV细胞中EYFP-YAP1和TEAD1-mScarlet-I表达的代表性图像。（C）代表性的（i）自相关和（ii）交叉相关数据，显示总EYFP-YAP1和TEAD1-mScarlet以及复合荧光蛋白（YAP1-TEAD1）的原始数据和拟合线。（D）EYFP-YAP1 WT、变异体和对照p.Ser94Ala的YAP1-TEAD1结合亲和力的解离常数（Kd）。N ≥ 3。p值使用普通单因素ANOVA和Dunnett的多重比较检验计算。条形图表示平均值±标准差。（E）从自相关数据测量的EYFP-YAP1 WT、变异体和对照p.Ser94Ala的扩散率。所有数据点均以条形图表示，中位数用条形图表示。p值使用普通单因素ANOVA和Dunnett的多重比较检验计算。（F）荧光素酶活性与EYFP-YAP1 WT和变异体的YAP1-TEAD1解离常数（结合亲和力的倒数）的关系。误差条表示±标准差。统计显著性定义为：p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***），p < 0.0001（****）；ns = 不显著。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图5. 第40天人视网膜类器官中YAP1的功能作用。（A-B）在类器官中经过7天selinexor（核蛋白输出抑制剂）处理后的YAP1表达，以及与DMSO对照组相比的YAP1核与细胞质定位的量化。Phalloidin表示皮质肌动蛋白。p值使用Mann-Whitney检验计算（N = 2，n ≥ 350）。[比例：10 μm]。（C）在7天0.25 uM Verteporfin（VPF；YAP1-TEAD抑制剂）处理后的视网膜类器官中caspase3和Phosphohistone H3（PHH3）的表达[比例：50 μm]。（D-E）与DMSO对照组相比，VPF处理后的增殖性（PHH3+）和凋亡性（Caspase3+）细胞的比较。每106 DAPI强度单位计算的PHH3+细胞数量显示VPF处理后的类器官中增殖活性显著降低。凋亡计算为每个感兴趣区域（ROI）中切割的Caspase3信号百分比。p值使用Welch's t检验计算。数据以平均值±标准差表示。N = 3。统计显著性定义为：p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***），以及p < 0.0001（****）；ns = 无显著性。为了测试YAP1的转录功能，我们将早期视网膜前体细胞（ROs）用verteporfin处理七天，verteporfin是一种抑制YAP1-TEAD结合的物质[52]。然后我们通过评估磷酸化组蛋白H3和切割的caspase-3阳性细胞的数量来评估视网膜前体细胞的增殖和凋亡情况。在0.25uM的verteporfin处理后，我们观察到增殖细胞显著减少，而凋亡细胞显著增加（图5C-E）。这表明YAP1-TEAD依赖的转录在人类视网膜前体细胞的增殖和早期视网膜发育过程中起着关键作用。

4. 讨论
确定与裂孔畸形相关的YAP1错义变异的致病性需要整合基因表达研究、基因功能机制知识以及病例级数据的证据。在这里，我们展示了YAP1及其相互作用伙伴（TEAD1–4）和下游靶基因（CTGF、CYR61、AMOTL2、AXL、BIRC5、MYC）在发育中的眼睛的多个组织中都有表达，包括眼周间充质、神经视网膜和RPE。对早期ROs的转录组分析揭示了四种主要的YAP1剪接异构体，其中三种含有两个WW结构域，这些异构体会受到第二个WW结构域变异的影响。另一种TSS异构体（Met179；ENSMBL ID：203）之前被认为可以绕过无义介导的降解并部分恢复YAP1的半剂量不足，但未在此检测到[4]。即使这种异构体被表达，它也缺乏TEAD结合结构域，限制了其恢复完整YAP1功能的能力。
像REVEL和AlphaMissense这样的计算机预测工具为预测错义变异对蛋白质功能的潜在影响提供了强大的方法[23][26]。然而，在这里测试的六个YAP1变异中，只有p.Phe95Ser和p.Ser257Phe在多个计算机工具中被一致预测为致病性变异。结构建模进一步支持了这些变异的致病性。此外，我们的建模表明p.Val55Leu可能因为范德华力（vdW）冲突而具有致病性，而p.Met86Thr可能因为引入了极性侧链到关键的疏水TEAD结合界面而具有致病性。与预测一致，我们的体外研究显示这些变异导致了定位、转录活性或TEAD结合的变化。值得注意的是，一些计算工具一致预测为良性的变异仍然导致内源性YAP1–TEAD靶基因的诱导减少，这突显了当前计算机方法的局限性以及功能验证的价值。不出所料，我们对YAP1的体外功能测试显示了实验依赖性效应（表3）。例如，TEAD结合结构域的变异在TEAD依赖的荧光素酶测定中影响最大，而WW结构域的变异主要影响YAP1的亚细胞定位。这些发现可能反映了YAP1不同结构域与不同蛋白质伙伴的独特相互作用，表明不同结构域的变异通过不同的机制驱动致病性。

表3. YAP1变异测定的实验结果比较
| 变异 | 蛋白质降解 | 蛋白质建模致病性预测 | 定位 | TEAD依赖的转录活性 | YAP1-TEAD结合亲和力 | 下游靶基因表达 |
|-----------------|--------------|-----------------|-----------------|--------------|-----------------|-------------|
| p.Val55Leu | 否 | 无 | 无效应 | 无效应 | 无效应 | 减少 |
| p.Met85Thr | 否 | 更多细胞质 | 无效应 | 减少 | 减少 |
| p.Phe95Ser | 是 | 稍多细胞质 | 减少（不显著） | 减少（最低） | 减少 |
| p.Lys254Arg | 否 | 否 | 无效应 | 无效应 | 减少 |
| p.Ser257Phe | 是 | 更多核内 | 无效应 | 减少 |
| p.Glu356Asp | 否 | N/A | 无效应 | N/A | 最大减少 |

一个关键的相似点是，所有变异在诱导内源性靶基因CYR61和CTGF的表达方面都显著低于野生型YAP1，其中TAD变异（p.Glu356Asp）的影响最为明显。TAD通过与染色质修饰复合体和其他调节转录机制的蛋白质的相互作用起作用，表明所研究的TAD变异会影响所有YAP1依赖的转录[53]。
为了评估YAP1转录中断的相关影响，我们使用了早期ROs。尽管ROs的整体形态与发育中的眼睛不同；没有相邻的发育中的RPE，也没有视裂，且整体形状也不同，但ROs仍然能够再现早期视网膜上皮的细胞类型组成。因此，它们提供了一个模型来研究视网膜前体细胞的增殖、细胞内蛋白质定位和视网膜细胞命运的调节。
我们用verteporfin处理ROs，verteporfin是一种抑制YAP1-TEAD相互作用的物质，结果发现YAP1-TEAD依赖的转录对视网膜前体细胞的增殖有积极作用，并且对人类视网膜发育至关重要。这与视网膜特异性YAP1敲除小鼠模型的观察结果一致，该模型表现出视网膜前体细胞增殖减少、凋亡增加、裂孔畸形和小眼症[8]。在人类研究中，ATAC-seq发现TEAD结合位点在类器官中的视网膜前体细胞中富集[54]。此外，用MGH-CP1（一种TEAD抑制剂）处理类器官后，观察到视网膜前体标记物VSX2减少；增殖细胞减少；凋亡略有增加[54]。这些观察结果表明，除了YAP1之外，TEAD转录因子中的错义变异也可能导致眼部疾病，如裂孔畸形。有趣的是，TEAD1中的p.Tyr421His变异已被报道会导致视网膜、RPE和视神经附近的脉络膜出现类似裂孔畸形的脉络膜视网膜病变[55][56]。
我们的发现表明，裂孔畸形可能是由于YAP1功能丧失引起的，无论是通过TEAD结合的变化还是通过调节机制的变化。例如，p.Ser257Phe的核定位增加，可能是由于LATS 1/2结合的改变，但这并没有增加靶基因的表达，反而内源性靶基因的表达减少了。Hippo通路上游其他基因的变异也与裂孔畸形有关。例如，正调控因子FAT1的移码突变会导致裂孔畸形和小眼症。虽然癌细胞的研究表明FAT1的丧失会导致YAP1的核定位和转录活性增加[57]，但在原代RPE细胞中FAT1的丧失并未影响YAP1的定位或活性[58]。总的来说，这些发现支持YAP1活性丧失是裂孔畸形的可能机制，尽管不能排除YAP1调节在眼部细胞类型上的特异性差异。
我们展示了YAP1–TEAD转录活性对于维持增殖的视网膜前体细胞是必不可少的，并假设YAP1变异患者的增殖减少可能会破坏视网膜形态并阻碍视裂闭合。然而，可能还有其他依赖于YAP1的过程对视裂闭合很重要，但这些过程在视网膜类器官模型中缺失。在胚胎融合之前，视裂边缘的细胞会经历基底膜降解、顶端重塑、类似EMT的转变以及随后的细胞混合和重组，形成连续的神经视网膜和RPE细胞层[59][60]。YAP1在裂隙边缘的机械感应可能调节这些动态过程，可能与其他对眼部发育必要的通路结合。例如，TGF-β信号传导是这种过程的关键调节因子，小鼠中TGF-β2的失活会导致视裂融合失败和裂孔畸形[61]。YAP1–1和YAP1–2都介导EMT，但TGF-β主要增加YAP1–2的稳定性，增强其核定位，并促进细胞迁移[62]。第二个WW2结构域的变异可能会损害这种依赖于TGF-β的YAP1–2的EMT，从而导致裂孔畸形。同样，BMP信号的精确调节对视裂闭合也很重要。YAP1可以通过其两个WW结构域与SMAD1/5结合，后者是BMP通路的转录介质，从而可能影响下游靶基因[63]。此外，Wnt通路和β-连环素的消除会导致裂孔畸形，增加细胞质中的YAP1会增强β-连环素与其降解复合体的结合，从而减少WNT靶基因的表达并影响RPE的分化[64][65]。
总之，这项研究通过结合视网膜类器官模型和对疾病相关变异的功能评估，提供了关于YAP1在人类早期视网膜发育中功能的新见解。这种综合方法提高了我们对YAP1在人类视网膜发育中作用的理解，并为解释YAP1变异的临床意义提供了框架。下一个合乎逻辑的步骤是将这些变异引入hiPSCs，并检查它们对视网膜类器官生长和成熟的影响，从而更直接地评估其在视网膜组织中的致病性。

CRedI作者贡献声明
Srishti Silvano：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原始草稿，可视化，方法学，调查，形式分析，概念化。
Van Annika Rick-Lenze：可视化，方法学，调查，形式分析，概念化。
James Bagnall：可视化，方法学，形式分析。
Mrinalini Saravanakumar：调查，形式分析。
Xinyu Yang：调查。
Robert Lea：调查。
Lindsay Birchall：方法学，调查。
Julie R. Jones：调查。
Jessica M. Davis：调查。
Jacob Sampson：形式分析。
Milena Zitnik-Sergeant：形式分析。
Anzy Miller：监督，方法学。
Rachel E. Jennings：方法学。
Elliot Stolerman：调查。
Jamie M. Ellingford：监督。
Simon C. Lovell：可视化，形式分析。
Forbes Manson：监督，方法学，概念化。
Gavin Arno：监督，概念化。
Panagiotis I. Sergouniotis：写作 – 审稿与编辑，监督，方法学，概念化。
Cerys S. Manning：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原始草稿，监督，方法学，概念化。

伦理批准
人类胚胎材料是根据西北研究伦理委员会（23/NW/0039）的伦理批准以及英国人类组织管理局发布的实践准则和2008年人类组织法案的立法从医疗和手术终止妊娠中收集的。所有参与者都获得了知情同意。对于裂孔畸形患者的数据，其家属签署了纳入研究的知情同意书。同意书得到了Self Regional Hospital机构审查委员会的批准。

关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来检查和澄清语法并减少字数。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

资金来源
我们感谢以下资金来源：MRC（MR/N013751/1，MRC DTP奖学金给S.S.和MR/V032534/1，职业发展奖给C.M.）；Wellcome Trust（224643/Z/21/Z，临床研究职业发展奖学金给P.I.S.）；NIHR曼彻斯特生物医学研究中心（NIHR 203308给P.I.S.和J.M.E.）；NIH（P20 GM139769给G.A.）；Macular Society（给J.M.E.）；Fight for Sight（给J.M.E）；Diabetes UK Harry Keen中级奖学金（20/0006263给R.E.J.和L.B.）。