代谢组学揭示了铜绿假单胞菌（Cupriavidus necator）中乙酸与甲酸在双碳PHB生物合成过程中的兼容性

《Bioresource Technology》：Metabolomics Reveals Acetate-Formate compatibility for Dual-Carbon PHB biosynthesis in Cupriavidus necator

双碳策略下醋酸与甲酸协同提升聚羟基丁酸（PHB）生产效率及机制研究。通过优化野生型铜绿假单胞菌H16的生理参数，在批式、补料分批和pH恒定培养中，实现PHB含量84%、产量7.3±0.9g/L。代谢组学分析表明甲酸氧化缓解能量限制，促进碳高效转化为PHB。为可持续生物塑料生产提供新策略。

　　

阿里亚·阿里亚（Aliyah Aliyah）、菲莱蒙·贾卢·努桑塔拉·普特拉（Filemon Jalu Nusantara Putra）、诺瓦·拉赫马多纳（Nova Rachmadona）、森勇太郎（Yutaro Mori）、普里哈迪·卡哈尔（Prihardi Kahar）、小野千秋（Chiaki Ogino）

日本兵库县神户市奈多区六角台町1-1，神户大学工程研究生院化学科学与工程系，邮编657-8501

摘要

使用有机底物生产聚羟基丁酸酯（PHB）时，当使用单碳源时，通常会受到能量不平衡的限制。虽然甲酸可以通过电化学CO₂还原轻松生成，但作为主要碳源时，它无法维持较高的生物质和聚合物产量。同样，乙酸为PHB生物合成提供了必要的骨架结构，但缺乏驱动高产积累所需的能量。为了弥补这一差距，我们在野生型Cupriavidus necator H16中实施了一种双碳框架，将能量供应与碳同化分离，其中甲酸氧化作为ATP和NADH的专用来源，使乙酸能够优先用于生物合成。在优化生理参数后，该过程在批次培养、连续培养和pH恒定培养模式下进行了评估，实现了84%的PHB含量和7.3?±?0.9?g L^?1的浓度。相对定量代谢组学进一步表明，甲酸衍生的能量缓解了与乙酸相关的能量限制，从而提高了碳转化为生物聚合物的效率。总体而言，本研究系统地评估了乙酸-甲酸底物在C. necator中生产PHB的兼容性，为将有机酸原料整合到可持续生物塑料工艺中提供了设计原则。

引言

塑料生产的不断增长对气候缓解和资源可持续性提出了挑战，因为该行业严重依赖化石碳源，并每年排放数百亿吨CO₂（Stegmann等人，2022年）。此外，塑料废物在环境中积累，形成持久的微塑料，威胁生态系统和人类健康（Yao等人，2025年）。像聚羟基丁酸酯（PHB）这样的生物塑料如果使用可再生或CO₂衍生的原料生产，可以作为一种可生物降解的替代品和临时的碳汇。Cupriavidus necator是一种革兰氏阴性兼性化能营养菌，由于其代谢灵活性和高聚合物积累能力而被广泛用于PHB生产（Morlino等人，2023年；Weldon和Euler，2025年）。表1...

尽管像果糖这样的糖类在C. necator中具有很高的发酵效率，并支持更好的PHB生产（Khanna和Srivastava，2005a年），但它们的使用引发了可持续性担忧，因为它们与食物和饲料存在竞争（Weldon和Euler，2025年）。此外，从糖类生产PHA的最大理论产量约为每克碳源0.4–0.5?g，限制了整体碳转化效率（CCE）（Yamane，1993年）。这些限制凸显了需要具有更好可持续性和碳利用效率的替代非食物碳源。在这种情况下，像甲酸这样的CO₂衍生有机酸很有前景，因为它们可以通过使用可再生电力进行电化学CO₂转化来生产，从而将捕获的温室气体转化为高纯度化学品，同时避免了作物糖类的土地使用限制（Haas等人，2018年；Hegner等人，2020年；Zhang等人，2022年）。然而，单独使用甲酸不足以支持生物质生长或PHB积累，因为Calvin–Benson–Bassham（CBB）循环耗能高且效率低下（Aliyah等人，2025年；Claassens等人，2020年；Panich等人，2021年）。这些限制促使人们探索将能量生成与碳同化分离的混合碳策略。

混合碳策略，包括混合营养培养（Amer和Kim，2023年；Jawed等人，2022年；Unaha等人，2024年）、微量共喂养（Park等人，2019年）和pH恒定喂养（Garcia-Gonzalez和De Wever，2018年；Grunwald等人，2015年；Tanaka等人，2023年；Vlaeminck等人，2022a年），已被证明可以提高代谢生产力。使用挥发性脂肪酸（VFAs）实现了有效的混合营养生长（Chakraborty等人，2012年；Jawed等人，2022年；Kacanski等人，2022年；Park等人，2023年），并且据报道使用含有乙酸、乳酸、丁酸和乙醇的复杂农业废弃物底物可以实现高达约85%的PHA积累（Hernández-Herreros等人，2025年）。结合具有不同代谢入口点的底物可以灵活重新分配细胞内资源，提高生物质形成和产物产量（Liu等人，2020年）。然而，成功的实施关键取决于底物的兼容性；不匹配的组合可能会破坏代谢平衡并降低碳利用效率。Babel等人（Babel，2009年）表明，当单一底物的固定碳-能量比率无法满足生物合成需求时，就会出现这种效率低下现象，他们提出了一种基于能量描述符对底物进行分类的框架，将其分为能量受限或能量过剩类型。

基于这一概念，我们在野生型C. necator H16中应用了双碳策略，使用乙酸和甲酸。乙酸作为主要碳源，形成用于PHB合成的乙酰-CoA，但由于其低燃烧焓（894?kJ mol^?1）和高度氧化的碳状态，在能量上受到限制（Babel，2009年）。为了弥补这一不足，引入了甲酸作为辅助底物，主要作为能量供体，提供ATP和还原当量，使乙酸衍生的碳更有效地用于生物质和PHB的形成。

尽管使用乙酸等有机酸生产PHB已得到广泛研究（Dijkhuizen和Harder，1979年；Garcia-Gonzalez和De Wever，2018年；Vlaeminck等人，2022b年），但尚未有系统研究探讨过乙酸+甲酸的共利用，也未阐明C. necator中这种双碳系统的代谢相互作用。在这里，我们优化了关键参数，包括碳偏好、控制溶解氧的搅拌以及初始细胞密度，以建立稳健的基线。相对定量代谢组学揭示了甲酸氧化如何重塑细胞内代谢物池和辅因子。在这些见解的指导下，我们在批次培养、连续培养和pH恒定培养模式下评估了PHB的生产，强调了底物兼容性和能量平衡是高效利用CO₂衍生原料生产PHB的核心决定因素。

部分内容

培养基和底物准备

用于C. necator培养的两种培养基如下：富含营养的（NR）培养基含有2?g L^–1酵母提取物、10?g L^–1牛肉提取物和10?g L^–1蛋白胨，按照先前报道的方法制备（Kahar等人，2004年）。甲酸培养基由最小矿物质（MM）培养基组成，其中含有40?mM磷酸盐缓冲液和30?mM甲酸钠或乙酸钠作为唯一的碳和能量来源。MM培养基的组成改编自St?ckl等人（2020年），包含6.8?g L

混合条件和单一条件下的有机碳源比较

在装有100?mL MM培养基的500?mL Sakaguchi烧瓶中，在30°C和180?rpm的条件下评估了PHB生产的培养条件，初始OD为0.3。实验设计主要集中在双碳培养上，其中乙酸或甘油作为主要碳源，而甲酸作为辅助能量底物。特别包括甘油作为参考底物，以代表能量受限的碳源，因为其相对较低的...

结论

本研究表明，结合乙酸和甲酸的双碳策略通过缓解与乙酸代谢相关的能量和氧化还原限制，提高了C. necator中的PHB产量。通过优化培养参数并比较批次培养、连续培养和pH恒定培养模式，实现了高PHB生产力。代谢组学分析表明，甲酸氧化提供了额外的还原当量，支持呼吸作用产生的ATP并维持细胞内氧化还原状态

未引用的参考文献

Khanna和Srivastava，2005年；Satoh等人，2003年；Sonnleitner等人，无日期；Vlaeminck等人，2022年；Wang等人，2024年。

CRediT作者贡献声明

阿里亚·阿里亚（Aliyah Aliyah）：撰写——初稿、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。菲莱蒙·贾卢·努桑塔拉·普特拉（Filemon Jalu Nusantara Putra）：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、概念化。诺瓦·拉赫马多纳（Nova Rachmadona）：撰写——审稿与编辑、监督、方法学。森勇太郎（Yutaro Mori）：撰写——审稿与编辑、监督。普里哈迪·卡哈尔（Prihardi Kahar）：撰写——审稿与编辑、监督。小野千秋（Chiaki Ogino）：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

这项工作部分得到了可持续发展的科学技术研究伙伴关系（SATREPS）、日本科学技术机构（JST）/ 日本国际协力机构（JICA）的支持。这项研究还部分得到了GteX计划的日本资助（项目编号：JPMJGX23B4）。此外，这项工作还得到了开放创新平台产业-学术共创（COI-NEXT）的支持，JST项目编号：JPMJPF2102，日本科学技术机构