利用磁铁矿纳米粒子促进Methanosarcina barkeri的细胞外呼吸：导电性磁铁矿纳米粒子-膜复合物的形成

《Bioresource Technology》：Facilitating extracellular respiration of Methanosarcina barkeri with magnetite nanoparticle: Formation of conductive magnetite nanoparticle-membrane complex

磁场纳米颗粒促进甲烷氧化菌外源电子传递及其分子机制研究，通过转录组学揭示膜结合氢酶基因表达上调，证实磁铁矿纳米颗粒与细胞膜形成导电复合体，显著提升AQDS还原效率。

　　

林文龙|张俊哲|梁连福|李阳|赵志强|张耀斌

工业生态与环境工程国家重点实验室（大连理工大学），教育部，大连理工大学环境科学与技术学院，中国大连116024

摘要

I型甲烷八叠球菌（Methanosarcina）的细胞外电子转移（EET）与生物能源回收、温室气体排放、环境修复和金属腐蚀密切相关。然而，其细胞外呼吸受到细胞膜中甲烷吩嗪（MP）浓度较低的限制，导致导电性差和电子流受限。在本研究中，我们使用甲醇作为唯一的电子供体，蒽醌-2,6-二磺酸盐（AQDS）作为唯一的电子受体，培养了I型甲烷八叠球菌中最受研究的物种——Methanosarcina barkeri。在磁铁矿纳米颗粒存在的情况下，几乎所有的AQDS都被还原；而在没有磁铁矿纳米颗粒的情况下，只有不到50%的AQDS被还原。随着磁铁矿纳米颗粒浓度的增加，细胞蛋白和mcrA基因拷贝数的增加也随之增加。细胞形态观察显示，磁铁矿纳米颗粒高度聚集形成单层并覆盖在细胞表面，没有穿透细胞。当用半导体α-赤铁矿纳米颗粒替代磁铁矿纳米颗粒时，依赖于AQDS的细胞外呼吸也得到了促进，但增幅显著减弱。导电原子力显微镜（CAFM）和扫描电化学显微镜（SECM）的研究表明，磁铁矿纳米颗粒在细胞表面形成了导电的纳米颗粒-膜复合物，从而增强了细胞外电子转移。

引言

甲烷八叠球菌在全球范围内广泛分布，在土壤、沉积物和厌氧消化池中普遍存在（De Vrieze等人，2012年；Rotaru等人，2025年）。它们不仅能够代谢多种底物产生甲烷（如H₂/CO₂、乙酸酯和甲基化化合物（如甲醇和甲胺）（De Vrieze等人，2012年），还能将这些底物以及甲烷的氧化产生的电子转移到细胞外的电子受体上，如矿物质（Bond和Lovley，2010年；Yang和Lu，2022年）、金属（Holmes等人，2018a年；Zhang等人，2014年）、电极（Yu等人，2021年）、腐殖酸（Song等人，2023年）以及类似腐殖酸的蒽醌-2,6-二磺酸盐（AQDS）（Holmes等人，2019年）。某些甲烷八叠球菌物种还能从Fe(0)和电极中摄取细胞外电子（Holmes等人，2022年；Rowe等人，2019年）。所有甲烷八叠球菌物种都能通过种间电子转移（DIET）将CO₂还原为甲烷（Zhou等人，2021年）。甲烷八叠球菌所执行的多种碳和电子流动在生物能源回收、温室气体排放、环境修复和金属腐蚀中起着关键作用。

根据栖息地和能量代谢机制的不同，甲烷八叠球菌被大致分为两类（I型和II型）（Rotaru等人，2025年；Zhou等人，2021年）。I型甲烷八叠球菌偏好碳和电子流速较高的环境，如厌氧消化池或富含有机物的土壤，并且即使提供乙酸酯作为底物，也能利用细胞内的H₂循环（Bond和Lovley，2010年；Kulkarni等人，2018年）。相比之下，II型甲烷八叠球菌偏好碳和电子流速较低的环境，如沉积物，并且不能利用细胞内的H₂循环（Wang等人，2011年；Zhou等人，2021年）。I型和II型甲烷八叠球菌都能进行细胞外电子转移（EET）（Zhou等人，2021年）。II型甲烷八叠球菌中最受研究的物种M. acetivorans能够通过EET保存能量以支持其生长，这一过程依赖于多血红素膜结合型细胞色素MmcA（Holmes等人，2022年；Holmes等人，2019年；Holmes等人，2021年）。而I型甲烷八叠球菌不含多血红素细胞色素，除了M. mazei中发现的五血红素细胞色素（其功能尚不清楚）（Yee和Rotaru，2020年），I型甲烷八叠球菌的EET机制仍不清楚。

现有证据表明，I型甲烷八叠球菌的EET涉及氧化还原活性膜结合蛋白。例如，I型甲烷八叠球菌中最受研究的物种M. barkeri拥有三种类型的氢化酶：依赖铁氧还蛋白的节能氢化酶（Ech）、辅酶F₄₂₀还原氢化酶（Frh）和依赖甲烷吩嗪（MP）的氢化酶（Vht），其中两种（Ech和Vht）是膜结合型的（Lovley，2018年）。先前的一项研究（Yu等人，2021年）发现，当使用甲烷作为电子供体时，M. barkeri在NO存在下产生的电流密度急剧下降，这表明膜结合型氢化酶参与了向电极的电子转移。此外，膜结合型的F₄₂₀H₂脱氢酶（Fpo）和异硫氢化物还原酶（HdrDE）在EET中起关键作用。转录组学分析显示，当M. barkeri通过DIET生长时，这些基因的表达显著上调。这些结果表明，磁铁矿纳米颗粒诱导了M. barkeri中依赖于AQDS的细胞外呼吸，从而加深了对这种古菌中导电纳米颗粒介导的细胞外电子转移机制的理解。

引言

甲烷八叠球菌在全球范围内广泛分布，在土壤、沉积物和厌氧消化池中普遍存在（De Vrieze等人，2012年；Rotaru等人，2025年）。它们不仅能够代谢多种底物产生甲烷，还能将这些底物以及甲烷的氧化产生的电子转移到细胞外的电子受体上，如矿物质（Bond和Lovley，2010年；Yang和Lu，2022年）、金属（Holmes等人，2018a年；Zhang等人，2014年）、电极（Yu等人，2021年）、腐殖酸（Song等人，2023年）以及类似腐殖酸的蒽醌-2,6-二磺酸盐（AQDS）（Holmes等人，2019年）。某些甲烷八叠球菌物种还能从Fe(0)和电极中摄取细胞外电子（Holmes等人，2022年；Rowe等人，2019年）。所有甲烷八叠球菌物种都能通过种间电子转移（DIET）将CO₂还原为甲烷（Zhou等人，2021年）。甲烷八叠球菌所执行的多样化的碳和电子流动在生物能源回收、温室气体排放、环境修复和金属腐蚀中起着关键作用。

根据栖息地和能量代谢机制的不同，甲烷八叠球菌被分为两类（I型和II型）（Rotaru等人，2025年；Zhou等人，2021年）。I型甲烷八叠球菌偏好碳和电子流速较高的环境，如厌氧消化池或富含有机物的土壤，并且即使提供乙酸酯作为底物也能利用细胞内的H₂循环（Bond和Lovley，2010年；Kulkarni等人，2018年）。相比之下，II型甲烷八叠球菌偏好碳和电子流速较低的环境，如沉积物，并且不能利用细胞内的H₂循环（Wang等人，2011年；Zhou等人，2021年）。I型和II型甲烷八叠球菌都能进行细胞外电子转移（EET）（Zhou等人，2021年）。II型甲烷八叠球菌中最受研究的物种M. acetivorans能够通过EET保存能量以支持其生长，这一过程依赖于多血红素膜结合型细胞色素MmcA（Holmes等人，2022年；Holmes等人，2019年；Holmes等人，2021年）。相比之下，I型甲烷八叠球菌不含多血红素细胞色素，除了M. mazei中发现的五血红素细胞色素（其功能尚不清楚）（Yee和Rotaru，2020年），I型甲烷八叠球菌的EET机制仍不清楚。

现有证据表明，I型甲烷八叠球菌的EET涉及氧化还原活性膜结合蛋白。例如，I型甲烷八叠球菌中最受研究的物种M. barkeri拥有三种类型的氢化酶：依赖铁氧还蛋白的节能氢化酶（Ech）、辅酶F₄₂₀还原氢化酶（Frh）和依赖甲烷吩嗪（MP）的氢化酶（Vht），其中两种（Ech和Vht）是膜结合型的（Lovley，2018年）。一项关于M. barkeri利用甲烷作为电子供体产生电能的研究（Yu等人，2021年）发现，在NO存在下，这些氢化酶被不可逆地失活，导致电流密度急剧下降，这表明膜结合型氢化酶参与了向电极的电子转移。此外，膜结合型的F₄₂₀H₂脱氢酶（Fpo）和异硫氢化物还原酶（HdrDE）在EET中起关键作用。转录组学分析也支持这一观点，因为在M. barkeri通过DIET生长时，Fpo和HdrDE基因的表达显著增加，而通过种间H₂转移（IHT）生长时则没有这种增加（Holmes等人，2018b）。

然而，依赖氧化还原活性膜结合蛋白的EET可能会限制I型甲烷八叠球菌的细胞外呼吸。一个明显的例子是，M. barkerer虽然能够将电子转移到Fe(III)和AQDS上，但无法通过这些细胞外电子受体的还原来保存能量以支持其生长（Bond和Lovley，2010年）。这可能是因为M. barkerer细胞膜中负责在氧化还原活性膜结合蛋白之间传递电子的MP浓度较低，限制了跨膜电子流。事实上，M. acetivorans细胞膜中的MP浓度足够高，可以使细胞膜变成“电量子化”的导电材料（Duszenko和Buan，2017年），在这种情况下，M. acetivorans细胞膜中的电子流接近最佳状态（Duszenko和Buan，2017年）。相比之下，M. barkerer细胞膜中的MP浓度仅为M. acetivorans的三分之一，且M. barkerer的细胞膜不具备“电量子化”特性（Duszenko和Buan，2017年）。

为了增强I型甲烷八叠球菌的细胞外呼吸，形成细胞表面的导电复合物是必要的。那么，是否有其他方法可以在不增加MP浓度的情况下，在细胞表面形成导电网络来促进细胞外电子流呢？一项关于M. barkerer利用AQDS作为唯一电子受体进行厌氧甲烷氧化的研究（Liang等人，2024年）发现，磁铁矿纳米颗粒（一种广泛用于介导“电共生”的导电Fe(III)/Fe(II)矿物）可以加速甲烷的氧化，并促进M. barkerer的生长。需要注意的是，由于磁铁矿的磁性，它们容易聚集形成单层导电层（Wang等人，2018年）。因此，基于基因组证据的假设认为磁铁矿纳米颗粒特异性地激活了M. barkerer的氧化还原活性膜结合蛋白的观点是有争议的（Liang等人，2024年）。研究还表明，在磁铁矿纳米颗粒存在的情况下，生物膜的导电性比没有磁铁矿纳米颗粒时高出一个数量级（Liang等人，2022年）。这些结果表明，磁铁矿纳米颗粒在I型甲烷八叠球菌的细胞表面形成了导电复合物，从而促进了它们的细胞外呼吸。

在本研究中，我们使用甲醇作为唯一的电子供体，AQDS作为唯一的电子受体培养了M. barkerer。通过比较生成的AH₂QDS、总细胞蛋白和mcrA基因拷贝数，证明了磁铁矿纳米颗粒可以促进M. barkerer在细胞外电子受体存在下的生长。此外，通过导电原子力显微镜（CAFM）和扫描电化学显微镜（SECM）评估了M. barkerer的细胞表面导电性和EET能力。最后，通过转录组学分析了M. barkerer的氧化还原活性膜结合蛋白的基因表达，提出了M. barkerer在磁铁矿纳米颗粒存在下依赖于AQDS的细胞外呼吸的机制模型。

菌株和生长条件

M. barkerer菌株DSM 800从德国微生物与细胞培养物收藏中心（DSMZ）获得，在37°C下于120 mL血清瓶中厌氧培养。培养基使用5/10 mM甲醇作为电子供体，20 mM AQDS作为电子受体，并添加了10 mM 2-溴乙烷磺酸盐（SBES）。每个瓶子含有20 mL菌株和60 mL培养基。初始接种物中含有1100 μg/mL的总蛋白和2.36 × 10⁶拷贝/mL的mcrA基因。

磁铁矿纳米颗粒促进了M. barkerer在AQDS作为唯一电子受体存在下的生长

当培养基中同时含有甲醇作为电子供体和AQDS作为电子受体时，M. barkerer将AQDS还原为AH₂QDS，但没有产生甲烷（图1A和B）。当电子供体不足（5 mM甲醇和20 mM AQDS）时，在没有磁铁矿纳米颗粒的情况下，仅生成了9.1 ± 0.5 mM的AH₂QDS（图1A）。根据反应式：CH₃OH + 3AQDS + H₂O = 3AH₂QDS + CO₂，5 mM甲醇理论上可以用于还原15 mM的AQDS。

结论

磁铁矿纳米颗粒促进了I型甲烷八叠球菌（Methanosarcina）中最受研究的物种M. barkerer的依赖于AQDS的细胞外呼吸。在磁铁矿纳米颗粒存在的情况下，几乎所有的AQDS都被还原，这与II型甲烷八叠球菌中最受研究的物种M. acetivorans的情况相似；而在没有磁铁矿纳米颗粒的情况下，只有不到50%的AQDS被还原。磁铁矿纳米颗粒在细胞表面高度聚集。

CRediT作者贡献声明

林文龙：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，正式分析，数据管理。张俊哲：方法学，实验研究，正式分析，概念化。梁连福：方法学，实验研究。李阳：指导。赵志强：可视化，指导。张耀斌：指导。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢中国国家重点研发计划（2021YFA1201702）和中国国家自然科学基金（52470140）的财政支持。