《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Waterborne Electrospun α-Lactalbumin/Soy Protein Isolate Nanofibers for Wound Healing
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伤口愈合是一个复杂的多阶段生物过程，开发可加速组织修复的创新疗法和可持续多功能生物材料是重中之重。本研究展示了一种绿色的、基于多种蛋白质的纳米纤维系统，它通过水基静电纺丝以水为唯一溶剂制备而成。该系统由α-乳白蛋白(ALA)和大豆分离蛋白(SPI)组成，蛋白质含量高达90% (w/w)。在大鼠三度烧伤模型中，ALA/SPI/PEO纳米纤维相对于对照组显著改善了伤口愈合结果，表现为加速再上皮化、增加胶原沉积和增强血管生成。该多蛋白纳米纤维系统整合了可持续性、材料设计和治疗功效，为下一代生态友好型且可临床转化的生物材料提供了一个有吸引力的蓝图。
皮肤受伤后，身体会启动一个精密的修复程序，但像严重烧伤这样的复杂伤口，常常难以顺利愈合。理想的伤口敷料需要身兼数职：既要保持伤口湿润、透气、吸收渗出液，还要抵御细菌入侵，并为细胞的粘附、迁移和增殖提供支持，最终促进组织再生。传统的纱布敷料往往难以满足这些多元需求。近年来，静电纺丝纳米纤维因其能够模拟天然细胞外基质的纳米结构而备受关注，但大多数制备过程需要使用有机溶剂，存在环境毒性和生物相容性隐忧，且常用的合成聚合物材料往往缺乏支持愈合过程所需的生物活性。蛋白质基纳米纤维虽然具有天然生物活性和良好降解性，但在静电纺丝过程中常常面临可纺性差、所得纤维水稳定性不佳等挑战。为此，来自哥本哈根大学的研究团队独辟蹊径，开发了一种全绿色的解决方案。他们以水为唯一溶剂，将两种具有不同特性的天然蛋白——α-乳白蛋白(ALA)和大豆分离蛋白(SPI)——结合起来，通过“水基静电纺丝”技术，成功制备出蛋白质含量高达90%的纳米纤维敷料。这项旨在攻克蛋白质基材料临床转化难题的创新研究，成果已发表在《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》上。
为了评估这种新型多蛋白纳米纤维的性能，研究人员采用了几项关键技术。他们通过扫描电子显微镜(SEM)系统分析了不同配比(ALA/SPI/PEO)纳米纤维的形貌和直径分布。通过将纳米纤维圆片浸入水中或置于离体肌肉组织上，直观评估了其在水环境和生物相关环境中的稳定性。利用动态力学分析(DMA)测定了纳米纤维的力学性能，包括杨氏模量(YM)、极限抗拉强度(UTS)和断裂伸长率(EAB)。采用BCA蛋白测定法，定量分析了纳米纤维在水中不同时间点的蛋白质释放行为。研究的核心——体内疗效评估，是在获得沈阳药科大学动物伦理委员会批准后，利用SD雄性大鼠建立的三度烧伤模型上进行的。研究人员比较了空白对照组与使用37.5A/52.5S（即37.5% ALA, 52.5% SPI, 10% PEO）双纳米纤维片治疗组的伤口愈合情况，通过定期拍摄伤口照片并计算伤口闭合率来评估愈合速度。在实验终点（第21天），采集伤口组织进行苏木精-伊红(H&E)染色、马松三色(Masson’s trichrome)染色以及CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫荧光双染色，从组织病理学层面深入评估再上皮化、胶原沉积和血管生成情况。
3.1. 高蛋白含量ALA/SPI纳米纤维可通过水基静电纺丝制备
研究人员成功以水为唯一溶剂，制备了蛋白质含量高达90%的ALA/SPI/PEO纳米纤维。扫描电镜结果显示，不同配比的纳米纤维形貌均匀，且具有可调节的直径。例如，纯SPI纤维(75S)致密，平均直径约465 nm，而纯ALA纤维(75A)直径更大(约951 nm)。多蛋白纤维(如37.5A/52.5S)的直径(约622 nm)和形貌介于两者之间。通过调节ALA与SPI的比例，可以在不改变溶剂和仅使用少量PEO（最低至5%）的情况下，对纳米纤维的形貌进行有效调控，这为设计具有特定结构的生物材料提供了灵活策略。
3.2. 纳米纤维的润湿性能受ALA和SPI含量调控
水稳定性是伤口敷料的关键性能。研究发现，纯ALA纳米纤维(75A)遇水后1分钟内完全溶解，而纯SPI纳米纤维(75S)可在水中保持圆片形状长达7天。多蛋白纳米纤维的水稳定性介于两者之间，且可通过调节SPI比例进行精细调控。例如，SPI含量较高的37.5A/52.5S可在水中维持结构至第4天，而在离体肌肉组织上可稳定至少5分钟。这证明了通过简单改变蛋白质配比，即可获得满足伤口湿润环境要求的稳定性，无需额外的化学交联步骤。
3.3. ALA:SPI比例影响纳米纤维的力学性能
力学性能测试表明，蛋白质组成显著影响纳米纤维的机械特性。高SPI含量的纳米纤维(90S)表现出最高的极限抗拉强度和杨氏模量（即更刚硬），但延展性较低。相反，高ALA含量的纳米纤维(90A)具有更高的断裂伸长率（即更柔韧）。多蛋白纳米纤维(如37.5A/52.5S和52.5A/37.5S)则表现出介于两者之间的力学性能。这种差异源于两种蛋白质不同的二级结构：SPI富含刚性的β-折叠，而ALA富含更具弹性的α-螺旋。因此，通过调节ALA与SPI的比例，可以实现对材料力学性能的定制化设计。
3.4. 蛋白质释放依赖于ALA和SPI的特性及其协同作用
蛋白质释放行为的研究揭示了两种蛋白的协同效应。纯ALA纳米纤维中的蛋白质在1小时内完全释放，而纯SPI纳米纤维在7天内仅释放约28%。在多蛋白纳米纤维(37.5A/52.5S)中，使用FITC标记追踪发现，其中的ALA在1小时内快速完全释放，而SPI的释放量（约50%）则显著高于其在纯SPI纤维中的释放量。这表明快速水合的ALA可能在纤维基质中形成了孔道，促进了水分渗入，从而协助了原本疏水的SPI的释放。这种差异化的释放行为可能对实现时序性治疗功能具有重要意义。
3.5. ALA/SPI/PEO纳米纤维加速三度烧伤创面愈合
体内动物实验是检验疗效的金标准。在大鼠三度烧伤模型中，与空白对照组相比，使用37.5A/52.5S双纳米纤维片治疗的“纤维组”在所有时间点都表现出显著更优的伤口闭合率。在早期（第4天），纤维组即显示出约20%的闭合率（对照组约10%），这很可能得益于ALA的快速释放。到实验终点第21天，纤维组的伤口几乎完全闭合（接近100%），而对照组平均仅达到85%左右。伤口轮廓的模拟图像清晰显示，纤维组的伤口面积从早期到后期均持续、快速地缩小。
3.6. ALA/SPI/PEO纳米纤维增强组织再生
组织病理学分析为纳米纤维的促愈合机制提供了微观证据。苏木精-伊红染色显示，对照组伤口表皮未完全覆盖，真皮层仍有炎症细胞浸润；而纤维组伤口则形成了完整、连续的表皮层，炎症显著减轻，血管形态正常。马松三色染色表明，纤维组伤口的胶原纤维排列更有序、致密，显示出更成熟的胶原沉积，而对照组胶原则松散无序。免疫荧光染色结果更为亮眼：纤维组伤口区域的CD31（血管内皮标记）和α-SMA（血管平滑肌标记，标志血管成熟）双阳性信号显著多于对照组，且共定位更好，这表明纳米纤维治疗不仅促进了新血管的形成（ angiogenesis），还显著增强了这些新生血管的成熟和稳定，为伤口修复提供了坚实的营养和氧气供应基础。
综上所述，这项研究成功开发了一种绿色、可持续的高蛋白含量纳米纤维制备平台。研究表明，通过组合ALA和SPI，可以协同调控纳米纤维的形貌、水稳定性和力学性能，并实现蛋白质的差异化释放。在大鼠严重烧伤模型中的体内实验证实，这种多蛋白纳米纤维能显著加速伤口闭合，其机制包括促进再上皮化、增加并优化胶原沉积、以及有效促进血管生成与成熟。该研究的核心意义在于提出并验证了一种“蛋白质中心”的生物材料设计策略。在这种策略中，蛋白质不仅仅是构建支架结构的材料，其本身更是积极参与并驱动愈合过程的生物活性剂。同时，全程使用水作为溶剂的绿色制备工艺，避免了有机溶剂残留的毒性和对蛋白质天然构象的破坏，解决了临床转化的关键瓶颈之一。尽管未来仍需在电纺工艺标准化、细胞毒性深入评估以及与商业化产品进行系统对比等方面开展更多工作，但本研究无疑为开发下一代兼具优异性能、生物可降解性和环境友好性的创面敷料提供了一个极具吸引力的新蓝图。
