利用来自黑海鲷（Acanthopagrus schlegelii）的具有不同成肌潜能的肌肉来源细胞系，对成肌分化过程进行转录组学研究

《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Transcriptomic insights into myogenic differentiation using muscle-derived cell lines with distinct myogenic potentials from black sea bream (Acanthopagrus schlegelii)

黑海鲈鱼肌原分化转录组特征研究首次利用双系细胞模型揭示分化核心基因391个上调/275个下调，通过ECM受体相互作用与肌节组织调控的协同激活及代谢途径抑制，阐明细胞融合机制的关键基因Col1a1、Comp、Thbs2a，并经qRT-PCR验证，为水产生物技术提供分子标记基础。

　　

韩丹熙 | 郑恩秀 | 康彩婉 | 龔成杓

韩国釜山普吉延世大学渔业生物学系，48513

摘要

骨骼肌的生长是水产养殖生产力的主要决定因素，但由于缺乏精确的体外模型，黑海鲷（Acanthopagrus schlegelii）肌生成过程的分子机制仍不明确。在这项研究中，我们使用了两种具有不同肌生成潜力的肌肉来源细胞系进行了比较转录组分析：一种能够形成肌管（肌生成型），另一种则无法分化（非肌生成型），以分离出分化的核心转录特征。通过减法筛选策略，我们鉴定出391个上调基因和275个下调基因，这些基因特异性地驱动了肌生成过程。功能富集分析表明，分化是由一个同步的双重程序调控的：即“细胞外基质-受体相互作用”、“局部黏附”和“肌节组织”的强烈激活，以及“代谢途径”和“生长因子结合”的战略性抑制。具体而言，Col1a1、Comp和Thbs2a被鉴定为代表性重叠基因（ROGs），突显了基质重塑和细胞-基质相互作用在支持肌母细胞融合中的关键作用。同时，IGF信号轴和自噬相关基因的下调表明，代谢过程从以增殖为导向的生物量积累转变为以能量效率为导向的组织重塑。这些转录组谱型的可靠性通过qRT-PCR验证得到了证实，关键的结构调节因子（Col4a1、Itga6a、Mylpfb、Thbs2a）和代谢调节因子（Acss2l、Pfkfb3）的高一致性得到了验证。本研究为黑海鲷的肌生成过程提供了首个全面的转录组框架，为推进水产养殖生物技术和细胞农业应用提供了有力的分子标记和基础数据。

引言

在硬骨鱼类中，骨骼肌是含量最丰富的组织，根据物种的不同，可占体重的约60%（Johnston, 2001）。骨骼肌是产生游泳推力的主要器官，同时也是氨基酸和蛋白质的储存库，从而有助于维持全身的能量和营养平衡（Duran et al., 2021）。从工业角度来看，骨骼肌构成了鱼的可食用部分（例如鱼片），决定了水产养殖产品的质量和产量（Listrat et al., 2016; Ramos-Pinto et al., 2019）。鉴于其核心作用，了解鱼类肌肉在细胞和分子层面的发育机制对于改进水产养殖实践至关重要（Johnston, 2006; Johnston et al., 2011），并为新兴应用（如人工鱼肉生产）提供了概念框架（Goswami et al., 2024）。

肌生成被认为是一个逐步的过程，其中静止的卫星细胞被激活、增殖并分化形成多核肌管和功能性肌纤维（Morgan and Partridge, 2003; Shi and Garry, 2006; Fu et al., 2015）。这一过程受到肌生成调控因子（MRFs）家族转录因子以及来自微环境的信号的严格调控，其分子机制已在哺乳动物模型中得到了广泛研究（Le Grand and Rudnicki, 2007; Yin et al., 2013）。在硬骨鱼类中的类似证据也支持了保守机制的存在：在斑马鱼（Danio rerio）中，肌肉损伤后Pax7依赖的卫星样细胞被激活并发生增殖，随后诱导出肌生成分化标志物（Berberoglu et al., 2017）。然而，尽管有这些发现，硬骨鱼类肌生成细胞系中增殖状态与分化状态的转录特征仍不完全清楚。

最近的转录组研究开始揭示保守的以及硬骨鱼类特有的调控机制。在黑岩鱼（Sebastes schlegelii）中，使用已建立的肌肉细胞系进行的RNA-seq分析发现了数千个阶段特异性的差异表达基因（DEGs）。具体来说，增殖状态与细胞周期调节因子（如Kif22、Pola1）相关，而分化状态则富含收缩性和结构基因（如Myl3, Tnnt2）（Kong et al., 2021）。类似地，对斑点海鲈（Lateolabrax maculatus）原代肌肉细胞的研究利用RNA-seq和WGCNA表明，温度变化本身就可以系统地重新编程基因网络，包括HSF1信号传导、Ca²⁺调节和肌节组装（Zhang et al., 2022）。然而，鉴于硬骨鱼类之间的巨大生理和遗传多样性，特定物种中发现的转录特征不能普遍适用。此外，为了实现高重现性和最小化实验变异性，将系统分析扩展到来自不同水产养殖物种的已建立细胞系是必要的。因此，使用可靠的细胞系模型来表征黑海鲷的转录组图谱是全面理解硬骨鱼类肌生成过程的关键步骤。

在这项研究中，为了严格定义肌生成分化的转录特征，我们使用了两种具有不同肌生成潜力的黑海鲷肌肉来源细胞系：一种能够形成强健的肌管（肌生成型），另一种则无法分化（非肌生成型）。通过比较这两种细胞系在相同分化诱导条件下的转录组谱型，我们旨在过滤掉背景波动，并分离出特异性驱动肌生成过程的基因。这种比较方法使我们能够精确鉴定出与分化相关的基因，并通过qRT-PCR进行了验证。通过描绘阶段特异性的转录程序，并区分真正的肌生成调节因子和一般应激或培养响应基因，我们的发现为硬骨鱼类肌生成过程提供了分子路线图，并为未来的功能验证奠定了基础。

细胞培养

本研究使用了先前建立的两种黑海鲷肌生成型和非肌生成型细胞系：肌生成型细胞系（细胞系4）和非肌生成型细胞系（细胞系7），具体描述见Han和Gong（2024）。细胞培养在涂有0.1%（w/v）明胶（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）的细胞培养皿（PakGent Bioscience, Suzhou, Jiangsu, China）上进行。培养基为添加了20%...

确认黑海鲷细胞系的肌生成分化潜力

在转录组分析之前，重新评估了这两个细胞系的分化潜力，以验证它们是否适合本研究。在DM培养条件下，肌生成型细胞系成功发生了分化，形成了大量的多核肌管，而非肌生成型细胞系保持了单核形态，没有形成肌管（图1A和B）。定量分析显示，肌生成型细胞的融合指数达到了33.5 ± 4.8%

讨论

本研究通过比较转录组分析揭示了肌生成型和非肌生成型细胞群体之间的基因表达明显差异，强调了分化过程中特定谱系的转录程序的建立。与哺乳动物模型一致，其中肌生成是由收缩性和结构网络的协调激活驱动的（Yin et al., 2013; Hernández-Hernández et al., 2017），我们的分析表明，鱼类肌生成细胞受到...

结论

本研究首次使用经过验证的比较细胞系模型，对黑海鲷（A. schlegelii）的肌生成分化进行了全面的转录组表征。通过对比肌生成型和非肌生成型细胞系，我们成功定义了特定谱系的转录特征，过滤掉了非特异性的培养反应。我们的发现表明，硬骨鱼类的肌生成是由一个同步的双重程序调控的：即细胞外基质重塑的强烈激活...

CRediT作者贡献声明

韩丹熙：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理。郑恩秀：撰写——原始草稿、可视化、正式分析。康彩婉：撰写——原始草稿、正式分析。龚成杓：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了普吉延世大学（2025年）的研究资助。