一种氨基肽酶N的同源物与日本对虾（Penaeus japonicus）对白斑综合征病毒（white spot syndrome virus）的感染易感性有关

《Fish & Shellfish Immunology》：An aminopeptidase N homolog is associated with white spot syndrome virus infection susceptibility in Penaeus japonicus

白斑综合征病毒感染中虾氨基肽酶N-like基因的功能解析及宿主机制研究，通过RNA干扰和转录组学发现该基因敲低抑制病毒复制并改变宿主细胞周期及免疫通路，证实其为病毒感染的关键宿主因子。

　　

Feng Xu|Donghao Li|Chuantao Zhang|Xiangshan Sun|Jingxian Huang|Hengde Li|Yaqun Zhang

上海海洋大学渔业与生命科学学院，中国上海

摘要

日本对虾（Penaeus japonicus）是一种具有商业价值的对虾物种，其可持续水产养殖受到白斑综合征病毒（WSSV）的严重威胁，导致巨大的经济损失。尽管氨基肽酶N（APN）是一种多功能蛋白质，在哺乳动物和昆虫中可作为多种病原体的受体或宿主因子，但其在甲壳类动物抗病毒免疫中的作用仍不明确。在本研究中，我们通过RNA干扰和时序转录组分析，在日本对虾中鉴定并功能表征了一种类似氨基肽酶N的基因（Pjapnl），表明该基因参与了WSSV感染过程。Pjapnl的全长cDNA编码一种994个氨基酸的II型跨膜蛋白，属于M1家族的锌依赖性金属肽酶，与脊椎动物的APN具有高度序列保守性。Pjapnl在所有检测组织中均表达，其中在鳃和肝胰腺中的表达水平相对较高。RNAi介导的Pjapnl敲低显著抑制了病毒包膜蛋白VP28的表达，并降低了病毒挑战后的WSSV基因组拷贝数。时序转录组分析进一步显示，Pjapnl敲低与宿主生物合成和翻译相关过程的阶段特异性改变（感染后12小时）、细胞周期调节（感染后24小时）、RIG-I样受体信号通路的改变（感染后36小时）以及整个感染过程中的细胞外基质和细胞骨架重塑有关。重要的是，RT-qPCR验证表明，Pjapnl敲低伴随着感染早期多个免疫相关基因表达的降低，这可能反映了宿主信号传导的改变和/或由于病毒载量减少而产生的次级效应。这些发现表明PjAPNL是促进WSSV感染的重要宿主因子，并强调了其作为日本对虾抗病毒干预和选择性育种策略的潜在分子靶点。

引言

日本对虾是一种具有经济价值的海洋物种，也是全球养殖最广泛的虾类之一^[1]。由于其良好的营养价值、理想的口感和质地以及高效的运输性，日本对虾在亚洲和欧洲多个国家广泛养殖，占全球虾类水产养殖产量的5%以上^[2]。然而，其可持续水产养殖受到病毒性疾病的严重限制，其中白斑综合征病毒（WSSV）是影响十足类甲壳动物的最具破坏性的病毒病原体之一^[3]。WSSV具有广泛的宿主范围，可感染包括虾、蟹、小龙虾和龙虾在内的多种甲壳动物^[4]。WSSV爆发可在3-10天内导致受感染种群100%的死亡率，造成显著的经济损失^{[5], [6]}。到目前为止，尚无有效的治疗或预防措施，使得WSSV的管理成为持续的研究重点^[7]。 细胞反应在甲壳动物对WSSV感染的先天免疫中起着关键作用[8]。由于病毒进入和复制严重依赖于宿主细胞机制和宿主因子[9]，因此鉴定宿主模式识别受体（PRRs）及其相关的进入途径对于理解WSSV的发病机制至关重要[8], [10]。先前的研究表明，WSSV可以利用宿主表面分子和PRR相关的信号通路来促进病毒进入和复制；例如，WSSV会劫持内吞作用相关的PI3K/Akt/mTOR轴以促进感染[11], [12]。此外，最新证据表明，宿主来源的外泌体也参与WSSV感染期间的抗病毒调节。在泥蟹（Scylla paramamosain）中，外泌体miRNAs（miR-137和miR-7847）通过诱导血细胞凋亡来抑制病毒增殖[13], [14]。然而，参与WSSV进入和细胞内重编程的关键宿主膜蛋白和受体样因子尚未完全确定，甲壳类动物抗病毒免疫的调控网络仍不完整。 氨基肽酶N（APN/CD13）属于锌结合金属蛋白酶超家族，在植物、动物、昆虫和微生物中普遍表达[15]。它作为一种多功能酶、受体和信号分子发挥作用[16]。其已知功能包括肽降解（如脑啡肽、内啡肽、血管紧张素和催产素）、血管生成、细胞运动和粘附、抗原呈递、内吞作用和信号转导，这突显了其作为癌症治疗靶点的重要性[17], [18], [19], [20]。除了这些生理功能外，APN还是几种冠状病毒的细胞表面受体，包括人类冠状病毒229E（HCoV-229E）、猫肠冠状病毒（FECV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）、犬冠状病毒（CCV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）[21]。此外，APN还促进人类巨细胞病毒（HCMV）的感染[22]。在昆虫中，APN被确定为Bacillus thuringiensis（Bt）Cry毒素在中肠上皮细胞的刷状边界膜囊泡（BBMVs）上的特异性受体，在毒素诱导的致死性中起关键作用[23]。 尽管APN作为哺乳动物和昆虫中多种病原体的受体作用已被充分证实，但其在甲壳动物免疫中的作用，尤其是在对WSSV的响应中，仍不清楚。鉴于我们小组的初步转录组数据中观察到类似氨基肽酶N的基因（Pjapnl）显著上调，我们假设PjAPNL可能参与WSSV感染[24]。因此，我们旨在确定PjAPNL是否通过作为潜在的宿主因子影响病毒复制以及感染期间宿主免疫和细胞反应的调节因子来参与WSSV感染。 在这项研究中，我们从日本对虾中鉴定并表征了一种类似APN的基因，并研究了其在WSSV感染中的作用。通过基于RACE的克隆、系统发育分析、组织特异性表达谱分析以及RNAi介导的敲低和转录组分析，我们发现PjAPNL有助于病毒的有效复制。我们的发现将Pjapnl确立为一种促进病毒感染的宿主因子，并提供了关于其如何参与宿主细胞重编程以促进WSSV感染的见解，突显了其作为对抗白斑病新干预策略靶点的潜力。

动物和组织收集

本研究中使用的日本对虾来自中国山东省中国渔业科学院的Xiaying增养与实验站。实验前，所有虾都通过PCR检测确认不含WSSV。所有实验个体均饲养在充氧循环水箱中，温度维持在24°C ± 1°C，盐度维持在24‰ ± 0.5‰。本研究使用的水是莱州湾的天然海水。经过14天的适应期后

Pjapnl cDNA及其推导蛋白质的分子特征

日本对虾中的Pjapnl基因全长cDNA为4010 bp（GenBase C_AA131229.1），包含一个2985 bp的开放阅读框（ORF），编码一个994个氨基酸的蛋白质，以及一个415 bp的5′-UTR和一个580 bp的3′-UTR，末端有一个30 bp的polyA尾。PjAPNL蛋白质的分子式为C5062H7704N1320O1546S36，分子量为112.94 kDa，理论等电点（pI）为4.83。由于其不稳定指数为35.06，该蛋白质预计是稳定的。

讨论

WSSV的分子发病机制及其与宿主防御的复杂相互作用是甲壳动物免疫学中的核心主题。我们的研究首次全面功能表征了日本对虾中的Pjapnl基因，证实了它是一种重要的促进WSSV复制的宿主因子。通过整合分子、系统发育和转录组方法，我们证明了WSSV可能利用PjAPNL作为一个重要的调控节点来重新编程宿主

结论

本研究提供了证据，证明PjAPNL是日本对虾中的一种II型跨膜金属肽酶，作为促进WSSV感染的重要宿主因子。我们提出了一个多阶段模型，其中WSSV利用PjAPNL逐步重新编程宿主：早期阶段通过抑制宿主生物合成重新分配资源，中期阶段通过调节细胞周期建立有利于复制的环境，中期至晚期阶段减弱细胞内

CRediT作者贡献声明

Feng Xu：数据管理、研究、验证、方法学、软件、可视化、撰写——原始草稿。Donghao Li：研究。Chuantao Zhang：资源、方法学。Xiangshan Sun：资源、方法学。Jingxian Huang：资源、方法学。Hengde Li：概念构思、数据管理、正式分析、撰写——审阅与编辑、资金获取。Yaqun Zhang：资金获取、数据管理、研究、方法学、软件、可视化、撰写——审阅与编辑。

数据可用性

本研究生成的原始转录组测序数据已存放在中国科学院北京基因组研究所/中国国家生物信息中心的基因组序列档案（GSA）中，访问号为CRA034364。数据可在以下链接公开获取：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA034364

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了北京自然科学基金（编号6232042）、中央非营利机构专项科学研究基金、中国渔业科学院（编号2023TD25）以及国家自然科学基金青年科学家基金（编号32503157）的支持。