通过蛋白质组学研究，探讨了食用来自褐藻（Saccharina latissima）的岩藻多糖（fucoidan）的大西洋鲑鱼（Salmo salar）肠道免疫调节机制

《Fish & Shellfish Immunology》：Proteomic insights into intestinal immune modulation in Atlantic salmon (Salmo salar) fed fucoidan from brown seaweed (Saccharina latissima)

评估岩藻多糖对预幼态大西洋鳟鱼肠道免疫的影响，通过五周饲料实验结合质谱蛋白质组学，发现fucoidan显著增加CD8+细胞并激活多种免疫相关通路，表明其作为功能性饲料添加剂的潜力。

　　

Kathiresan Purushothaman | Byron Morales-Lange | Sérgio.D.C. Rocha | Lin Qingsong | Luis Mercado | Margaret ?verland | Charles McLean Press

挪威生命科学大学兽医学院临床前科学与病理学系，邮政信箱5003，奥斯，挪威

摘要

岩藻多糖是一种来自褐藻（如宽叶海带）的硫酸化多糖，具有免疫调节、抗氧化和抗菌等生物活性。本研究探讨了岩藻多糖通过饮食对大西洋鲑鱼(Salmo salar)肠道免疫系统的调节作用。为此，我们进行了为期5周的实验，每个水箱中饲养40条鱼，分别使用普通饲料（对照组）和含有0.2%岩藻多糖的饲料。实验后，通过鸟枪法蛋白质组学、富集分析以及免疫组化或ELISA检测特定生物标志物。结果显示，食用岩藻多糖的鱼群中CD8⁺细胞数量增加，同时与支链氨基酸降解、紧密连接、NOD样受体、TGF-β和PPAR信号通路相关的蛋白质也有所增加。此外，岩藻多糖组还表现出免疫相关通路的增强（如补体系统、抗原处理与呈递、T细胞受体信号传导、白细胞迁移和中性粒细胞胞外陷阱形成），以及染色体相关蛋白（如组蛋白H2A、核小体组装蛋白1类似物4）、分子伴侣（如HSP60、HSP90A、HSPB1）和凝集素（如甘露糖结合蛋白）的富集。岩藻多糖组肠道中的CD29、CD61、CD63和CD243等细胞表面标志物也有所增加，这些标志物与细胞迁移过程相关。分析表明，CD8⁺细胞及其他白细胞可能在营养调控下参与鱼类肠道免疫系统的重塑。总体而言，岩藻多糖能够调节先天性和适应性免疫机制，使其成为功能性水产饲料的潜在候选成分。

引言

水产养殖是全球食品产业中增长最快的领域之一，在满足可持续蛋白质来源的需求方面发挥着关键作用[1]、[2]、[3]、[4]。然而，集约化养殖方式使鱼类面临多种压力，包括传染病和环境问题（如海水温度升高和水中氧气含量下降），这些因素严重影响了养殖效率与鱼类福利[5]、[6]、[7]。为解决这些问题，能够调节免疫系统的饲料策略受到了广泛关注，以提高养殖物种的抵抗力和疾病抵抗力[8]。 在硬骨鱼类中，肠道免疫系统由一系列细胞和分子组成，用于抵御病原体，同时耐受有益微生物并与食物中的生物活性化合物相互作用。这种免疫识别依赖于模式识别受体（PRRs），包括C型凝集素受体（CLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLRs）。这些受体能够检测病原体相关分子模式（PAMPs），并触发宿主防御信号级联反应，从而协调炎症和抗菌反应[9]、[10]。例如，CLR信号通路在鱼类巨噬细胞中激活NF-κB通路，有助于黏膜免疫和肠道稳态[11]、[12]。类似地，β-葡聚糖和富含硫酸化岩藻多糖（如岩藻多糖）等饮食成分可以调节NOD受体，进一步增强细胞内病原体感知，实现精确的炎症调节和应激适应[13]、[14]。核受体（如过氧化物酶体增殖激活受体PPARs）在调节炎症和维持黏膜免疫平衡方面也起着关键作用，防止过度免疫激活对宿主组织的损害[10]。肠道作为黏膜器官，其免疫系统由生理途径和饮食免疫刺激物共同作用形成，不仅协调局部免疫，还影响其他免疫器官（如头肾和脾脏）的系统性反应[15]、[16]。因此，优化肠道健康对于提高鱼类抵抗力和支持可持续水产养殖至关重要。 含有真菌、海藻或植物成分的功能性饲料在水产饲料配方中受到关注。海藻因其多种生物活性化合物而成为有价值的生物质资源，尤其是岩藻多糖，这种从宽叶海带(Saccharina latissima)中提取的硫酸化多糖，在脊椎动物中表现出抗病毒、抗氧化、抗炎和免疫调节等多种益处[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。岩藻多糖的膳食补充剂在增强免疫力和疾病抵抗力方面显示出良好效果，使其成为可持续水产饲料开发的理想候选成分[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。将海藻提取物添加到水产饲料中还有助于改善生长表现和平衡肠道微生物群，使其成为传统饲料添加剂的替代品[25]、[26]、[27]。尽管海藻在人类营养中得到广泛应用，但其生物活性成分在水产养殖中的利用仍相对不足，这为蓝色生物经济增添了价值潜力。 关于岩藻多糖在水生动物中的分子机制的研究正在不断深入，但仅有少数研究探讨了其对水产养殖相关物种的关键免疫细胞和信号通路的影响。例如，Jin等人[28]观察到食用岩藻多糖的小龙虾(Procambarus clarkii)死亡率降低，这归因于岩藻多糖的免疫调节作用，特别是NF-κB上调和血细胞凋亡的增加；Nordvi等人[29]发现Undaria pinnatifida中的岩藻多糖通过产生分子伴侣HSC70来缓解大西洋鲑鱼(Salmo salar)的肠道炎症，这对细胞稳态至关重要；Rocha等人[22]发现宽叶海带(Saccharina latissima)中的岩藻多糖增加了与大西洋鲑鱼肠道淋巴管发育、趋化性、伤口愈合和细胞迁移相关的基因表达。这些基因表达的增加也与MHC-II⁺和CD3⁺细胞数量的增加有关，这些细胞与抗原呈递相关，同时GATA3（一种全局转录因子）也上调，提示可能存在Th2相关免疫反应[22]。然而，海藻对不同鱼类的影响具有物种特异性，还取决于添加量以及提取和后续处理过程[19]、[22]、[30]。 基于现有研究背景，本研究旨在更深入地探讨食用含岩藻多糖功能性饲料的鱼类肠道免疫系统。为此，我们在普通饲料中添加了来自宽叶海带的岩藻多糖提取物，制备出功能性饲料。随后，在5周的时间内，将普通饲料和功能性饲料分别喂给大西洋鲑鱼幼鱼（在转移至海水环境之前的关键生产阶段）。实验结束后，结合鸟枪法蛋白质组学和形态测量分析，以及与免疫细胞亚群和体液反应相关的免疫标志物（如细胞表面标志物、细胞因子和效应分子）的检测。

饮食制备与鱼类实验

Rocha等人[22]详细描述了鱼类实验的饮食制备和饲养方法。简而言之，为了评估岩藻多糖对大西洋鲑鱼幼鱼的生物学效应，本研究使用了两种饲料：对照组饲料（不含任何免疫刺激剂和生长促进因子），以及每千克含2克岩藻多糖的饲料（岩藻多糖添加到普通饲料中）。两种饲料均满足所有已知营养需求。

结果

形态测量分析显示，不同饮食组之间肠道简单折叠面积无显著差异（图1）。然而，特定免疫相关标志物的检测结果显示，食用岩藻多糖的鱼群中CD8⁺细胞数量显著增加（2.3倍），而对照组仅为1.0倍。其他参数（如总IgM、IL1β、IL12、IFNγ）在肠道或血浆中两组间无显著差异（图1）。

讨论

目前，海藻养殖业主要集中在生产直接供人类消费的生物质。然而，该行业面临诸多挑战，尤其是开发新的市场渠道以更广泛和高效地利用海藻生物质[48]。为了开发生物技术应用（包括水产动物饲料添加剂），从褐藻中提取岩藻多糖等生物活性化合物已成为一个值得关注的方向。

结论

虽然对照组饲料主要支持基础能量代谢（如糖酵解和类固醇生物合成），但岩藻多糖的添加改变了肠道中的先天性和适应性免疫网络。例如，食用岩藻多糖的鱼类表现出CD8⁺细胞数量增加，以及与NOD样受体PPAR和TGF-β信号通路、白细胞跨内皮迁移、抗原处理与呈递、T细胞相关的通路增强。 CRediT作者贡献声明 PK和BM-L：概念构思、方法设计、实验实施、数据可视化、初稿撰写及审稿编辑。SDCR：概念构思、实验设计、数据收集与分析、审稿编辑。LQ：方法设计、资源协调、数据收集与分析、审稿编辑。M?：概念构思、资金获取、项目管理、数据收集与分析、审稿编辑。CMP：概念构思、资金获取、初稿撰写及审稿编辑。 数据可用性 质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库提交至ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD071310。各饮食组检测到的蛋白质和KEGG术语的完整列表分别见补充文件1和2。其他额外数据可应要求提供。 资助 本研究由挪威研究委员会（RCN）通过Norwegian Foods of Norway（RCN 237841/030）和Trained Immunity and Nutritional Programming for Resilient Salmon项目（RCN 294821）资助。此外，LM还获得了智利研究与发展机构（ANID-Chile）的National Scientific and Technological Development Fund（FONDECYT 1231206）的资助。PK还获得了挪威生命科学大学（NMBU）的国际旅行资助。 利益冲突声明 作者无需要披露的相关财务或非财务利益。 致谢 感谢挪威生命科学大学（NMBU）鱼类实验中心的工作人员提供的帮助，同时感谢南丹麦大学（SDU）的Karsten Schj?dt提供的抗CD8抗体。