气体交换、蔗糖供应以及光照质量调节着代谢和解剖结构的变化，从而提高了微繁殖得到的Corymbia torelliana × C. citriodora幼苗的生产力

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Gas exchange, sucrose supply and light quality modulate metabolic and anatomical responses, enhancing productivity in micropropagated Corymbia torelliana × C. citriodora plantlets

　　摘要
植物组织培养是一种重要的无性繁殖技术，能够提高那些在苗圃中存活率或生根能力较低的物种的幼苗产量。本研究探讨了气体交换速率、蔗糖浓度和光照质量对Corymbia torelliana × C. citriodora两个杂交克隆体微繁殖的影响。评估了外生根插条的繁殖效率、形态生理发育和代谢反应以及离体存活率。实验中，外植体被培养在无气体渗透膜的密封容器中（[14 μL L?1 s?1 CO?]），或使用带有两种膜的容器（[25 μL L?1 s?1 CO?]），培养基为添加了0、15或30 g L?1蔗糖的JADS培养基。根据这些结果，选出了最佳的气体交换-蔗糖条件，并在后续实验中评估了不同的光源：荧光灯、白光LED、红/蓝LED（3:1）和蓝光LED。气体交换速率为14 μL L?1 s?1且蔗糖浓度为15 g L?1时，繁殖效率得到了提高。相反，较高的气体交换速率（25 μL L?1 s?1）增强了初级代谢物、有机酸和超氧化物歧化酶的活性，表明代谢和抗氧化反应得到增强。膜的存在和蔗糖的添加促进了更高的光合作用活性，而当使用膜和15 g L?1蔗糖时，离体存活率提高了三倍。光照质量显著影响了生长：白光LED降低了繁殖效率，蓝光促进了茎秆伸长，红/蓝光增加了生物量积累；在荧光灯下微繁殖的幼苗离体存活率是白光LED下的9到15倍。

引言
全球森林面积为41.4亿公顷（ha），其中约3.12亿公顷为人工林（FAO 2025）。2024年，巴西的人工林面积达到了1050万公顷，比2010年增加了58%（IBA 2020；IBA 2025）。由于气候条件历来有利于森林种植，巴西的森林主要分布在南纬15°至30°之间，包括东南部、中西部和南部地区（IBA 2025）。然而，气候变化已成为这些地区森林种植扩展和可持续性的日益重要的限制因素。这种扩展促使林业部门寻求更适合新挑战性种植条件的遗传材料。在这一背景下，Corymbia属植物，特别是其最重要的商业杂交种Corymbia torelliana × C. citriodora，因其广泛的遗传多样性（Araujo et al. 2020；Tambarussi et al. 2018）、与桉树相当的木材密度（Araujo et al. 2023；Massuque et al. 2023）、高生产力以及对非生物和生物胁迫的耐受性（Assis 2014；Reis et al. 2014）而受到重视。
在林业苗圃中，Corymbia的克隆幼苗生产主要采用微型插条的无性繁殖方法。然而，在这些条件下，其繁殖仍存在困难（Bryant and Trueman 2015）。通过使用来自木质块茎的插条、微型温室（Brondani et al. 2018；Lima et al. 2022）、生长调节剂（Maravilha et al. 2023）以及体外培养的建立和初步繁殖（Molinari et al. 2023；Trueman et al. 2018），已经取得了一些进展。鉴于Corymbia的高商业潜力，有效的繁殖策略对于提高幼苗产量和支持人工林的扩展至关重要。在这种情况下，腋芽微繁殖能够实现遗传优势的固定、体外恢复、高卫生质量以及大规模生产均匀的繁殖体，同时便于种质资源的保存和交换（Trueman et al. 2018；Xavier et al. 2021）。
在体外繁殖过程中，植物部分降低了自身的自养能力，变得更加依赖培养环境和外源碳源，这影响了其生理质量（Alves et al. 2024；Fortini et al. 2021）。这种异养系统使外植体暴露在高湿度、乙烯积累、低二氧化碳可用性、光合作用辐射减少和气孔功能障碍中，导致形态生理紊乱、污染易感性增加以及离体适应能力受限（Nguyen et al. 2020；Tisarum et al. 2018）。为了提高无性繁殖效果，已经成功采用了促进体外气体交换并减少蔗糖使用的策略（Fortini et al. 2021；Molinari et al. 2023；Tisarum et al. 2018），以及使用不同光谱光照质量的策略（Batista et al. 2018；Frade et al. 2023；Miranda et al. 2020；Rocha et al. 2026），这些方法用于开发木本植物的光自养或光混合营养系统，从而提高了微型插条的繁殖效率并促进了离体生根。
最近的研究强调了光照质量在体外繁殖中的重要性。光照对光合作用至关重要，它调节光形态发生反应，促进生物量积累和茎秆增殖（Li et al. 2023a；Silva et al. 2020），诱导解剖结构变化（Frade et al. 2023），增强代谢物和光合色素的生成（Batista et al. 2018；Rocha et al. 2026），并刺激不定根的形成，从而有利于离体适应（Farrokhzad et al. 2022；Frade et al. 2023）。相反，不适当的光照条件可能导致严重异常，如过度湿润、光漂白和组织坏死（Surakshitha et al. 2026）。
在植物组织培养中，高繁殖率对于加速具有高遗传和商业价值的杂交种的克隆繁殖至关重要，尤其是像Corymbia这样具有明显生根限制的物种。在这种情况下，结合减少蔗糖和优化光照质量的气体交换系统被认为是克服克隆障碍的有效策略，具有高自动化潜力、降低污染和提高商业规模的生产效率。然而，综合评估气体交换、碳供应和光照质量对Corymbia杂交体克隆体形态生理反应和幼苗存活率影响的研究仍然较少。
因此，本研究的目的是评估在体外通过腋芽微繁殖建立的Corymbia torelliana × C. citriodora两个杂交克隆体在以下条件下的形态生理反应、繁殖效率和幼苗存活率：（I）不同的气体交换速率和蔗糖浓度；（II）不同的光谱光照质量。

材料与方法
实验在巴西米纳斯吉拉斯州维索萨市维索萨联邦大学（UFV）应用生物技术研究所（BIOAGRO）的植物组织培养实验室II（LCT-II）进行。用于建立外植体的遗传材料为Corymbia torelliana × C. citriodora的两个杂交克隆体，分别称为C-1和C-2，这些克隆体保存在LCT-II的体外种质库中。这些克隆体之前已在我们的实验室的体外种质库中建立，并因其活力、在体外条件下的稳定性及其商业重要性而被选中。因此，这些基因型被认为是研究体外克隆繁殖的合适模型。
Corymbia杂交克隆体在25 × 150 mm的试管中培养，试管内含有10 mL的JADS培养基（Correia et al. 1995），培养基中添加了30 g L?1蔗糖（Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA）、100 mg L?1肌醇（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）、800 mg L?1 PVP-30（聚维吡咯烷酮；Vetec?）、6 g L?1琼脂（Plant TC Micropropagation Grade, Phytotechnology Laboratories?）、0.5 mg L?1 BA（6-苯基腺嘌呤；Sigma Chemical Co.）和0.01 mg L?1 NAA（α-萘乙酸；Sigma Chemical Co.）。培养物已进行到第83次继代培养，每约30天进行一次继代。每次继代时，只选择最健壮和形态最均匀的茎秆进行繁殖，以提高作为实验外植体来源的供体植物的质量和均匀性。需要注意的是，外植体的标准化基于表型特征，而遗传保真度的变化可能是长期体外培养的固有局限性。
作为外植体来源，使用了之前已经微繁殖的植物，从中切下含有大约三个微茎的簇状繁殖体，每个微茎长约0.5 cm，然后接种到相应的处理组中。每个含有三个微茎的繁殖体构成一个外植体。所有培养基的pH值在121°C下高压灭菌20分钟前调整至5.8。

实验I：气体交换和蔗糖浓度
每个培养容器接种四个外植体，每个外植体含有大约三个微茎。微茎被接种到容量为347 mL的玻璃容器中，每个容器含有50 mL的JADS培养基，培养基中添加了100 mg L?1肌醇、800 mg L?1 PVP-30、6 g L?1琼脂、0.05 mg L?1 BA、0.27 mg L?1 IBA（吲哚-3-丁酸；Sigma Chemical Co.），以及0或15 g L?1或30 g L?1蔗糖。蔗糖浓度的选择基于初步试验（数据未显示）。
使用了两种密封系统：无膜的刚性聚丙烯盖（RPC）[CO?交换速率为14 μL L?1 s?1]，以及带有两个直径10 mm开口的RPC，开口处覆盖有疏水性氟孔膜（PTFE；MilliSeal? AVS-045 Air Vent, Tokyo, Japan），孔径为0.45 μm [CO?交换速率为25 μL L?1 s?1]（图1）。

图1
(a) 使用的密封系统：1 – 刚性聚丙烯盖（RPC）[CO?交换速率为14 μL L?1 s?1]，2 – 带有两个膜的RPC [CO?交换速率为25 μL L?1 s?1]。
(b) 在体外培养30天的Corymbia torelliana × C. citriodora茎秆的培养容器。
(c) 1 – 初始外植体，2 – 体外培养30天后发育的茎秆，3 – 用于温室条件下离体生根的微型插条

实验在光照强度为60 μmol m?2 s?1（使用LI-250 A辐射计测量；LI-COR? Inc., Lincoln, NE, USA）的生长室中进行，光照周期为16小时，温度为25 ± 2°C，由四个荧光灯（HO Sylvania T12, 110 W, S?o Paulo, Brazil）提供。

实验II：光照质量的影响
微茎被接种到容量为347 mL的玻璃容器中，每个容器含有50 mL的JADS培养基，培养基中添加了100 mg L?1肌醇、800 mg L?1 PVP-30、6 g L?1琼脂、0.05 mg L?1 BA、0.27 mg L?1 IBA和15 g L?1蔗糖。容器用带有两个直径10 mm开口的刚性聚丙烯盖（RPC）密封，开口处覆盖有孔径为0.45 μm的PTFE膜，提供25 μL L?1 s?1的CO?交换率。
评估了四种光源：荧光灯[FL]（HO Sylvania T12, 110 W, S?o Paulo, Brazil）、白光LED灯[WL]（SMD 100, 18 W, Vilux?, Vitória, ES, Brazil）、红/蓝LED灯（3:1）[R/B (3:1)]（LabPARLL-HR / DB-480, 11.6 W, LabLumens?, Carapicuíba, SP, Brazil）和蓝光LED灯[BL]（LabPARLL-HR / DB-480, 11.6 W, LabLumens?, Carapicuíba, SP, Brazil）（图2）。

图2
(a) 不同光谱的绝对照度和波长分布：FL = 荧光灯；WL = 白光LED；R/B L (3:1) = 红/蓝LED（3:1）；BL = 蓝光LED。
(b) 在体外培养的Corymbia torelliana × C. citriodora茎秆的培养容器。
(c) 在体外培养30天后，在不同光谱下发育的Corymbia torelliana × C. citriodora茎秆。从左到右：FL；WL；R/BL（3:1）；以及BL。实验在生长室中进行了30天，光照强度为60 μmol m?2 s?1（使用辐射计标准化），由每种处理的相应光源提供。光谱使用光谱辐射计和Ocean Optics SpectraSuite数据采集软件（Ocean Optics?，美国佛罗里达州达尼丁）进行测量。该实验是基于之前实验的结果建立的。

**体外评估与分析**

**微型插条的发育和生产力**

30天后，评估了以下参数：长度≥1.5厘米且<2.0厘米的微型插条数量、长度≥2.0厘米的微型插条数量、叶片鲜重（LFW，毫克）、叶片干重（LDW，毫克）、茎干鲜重（SFW，毫克）以及茎干干重（SDW，毫克）。

**代谢活性（实验I）**

在17:00收集茎部样本，立即置于液氮中冷冻，然后研磨用于分析。按照Lisec等人（2006年）的方法，使用约20毫克的新鲜组织进行甲醇提取。光合色素的定量按照Porra等人（1989年）的方法进行。碳水化合物（淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖）的测定遵循Fernie等人（2001年）的方法。总蛋白含量的分析按照Gibbon等人（2004年）的方法进行。苹果酸含量的测定按照Nunes-Nesi等人（2007年）的方法进行。脯氨酸含量的测定采用Bates等人（1973年）提出的方法，并根据Felipe等人（2019年）的修改进行了调整。所有分析均在巴西维索萨联邦大学（UFV）植物生物学系的植物生长单元进行。

**体外光合活性**

体外光合速率的定量使用红外气体分析系统（Q-S151；Qubit Systems，加拿大安大略省金斯顿）和LoggerLite 1.8.1软件（Vernier Software & Technology Caliper，美国俄勒冈州比弗顿）进行，具体方法参考Costa等人（2014年）和Castro等人（2019年）的研究，并进行了相应的修改。照明室中使用红色LED灯作为光源，参考CO2浓度通过从体外环境中以300毫升/分钟的恒定流速泵入的空烧瓶（347毫升容量）中的空气来计算。

体外环境的温度和湿度使用Espec传感器（Thermo Recorder RS-11，Takai Espec Corp.）进行测量。在测量光合活性之前，植物在黑暗中放置12小时。光合速率以μmol CO2植物?1 s?1表示。

光合速率（A）使用以下公式计算：
$$\:A\left(\mu\:mol\:{m}^{-2}{s}^{-1}\right)=\:\frac{\varDelta\:{CO}_{2}}{Mol.Flow}$$$$\:\varDelta\:{CO}_{2}\left(ppm\right)=\:{CO}_{2}\:refer\text{e}\text{n}\text{c}\text{e}-\:{CO}_{2}\:sample$$$$\begin{aligned} Mol\:Flow = & \\ & \frac{{\frac{{Air\:flow\:rate\:\left( {L\:mi{n^{ - 1}}} \right)}}{{Ideal\:gas\:constant\:\left( {22.4} \right)\: \times \:\:temperature\:\left( K \right)}}}}{{\frac{{600000}}{{Leaf\:dry\:weight\:\left( {mg} \right)}}}} \\ \end{aligned}$$

**超氧化物歧化酶活性**

超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性使用从液氮中冷冻的100毫克新鲜茎部组织提取物测定，并在含有1%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮、1 mM苯甲磺酰氟和0.1 mM乙二胺四乙酸的0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.8）中匀浆。匀浆液在4°C下以12,000 rpm离心15分钟，上清液作为粗酶提取物（Bradford 1976）。

SOD活性根据Giannopolitis和Ries（1977年）的方法进行测定，并以U min?1 g?1蛋白表示，其中一个单位（U）对应于抑制50%硝基蓝四唑光还原所需的SOD量。

**解剖学特征**

30天后，收集第二对完全展开的叶片，并固定在4%戊二醛溶液中。样品通过乙醇系列脱水后嵌入甲基丙烯酸树脂（Historesin；Leica Instruments，德国）中。使用手动旋转切片机（RM2235；Leica Microsystems Inc.，美国）制备5微米厚的横截面。切片转移到玻璃载玻片上，用pH 3.2的甲苯胺蓝染色2分钟，然后固定在Permount? SP15-500（Fisher Scientific）中，并在配备数字相机（ICC50 HD；Leica，德国）的光学显微镜（DM750；Leica，德国）下观察。

**微型插条的体外存活率和幼苗高度**

微型插条的体外存活率在维索萨联邦大学（UFV）森林工程系的研究苗圃中进行。体外培养得到的伸长茎部被转移到苗圃中，收集微型插条时用流水冲洗掉剩余的培养基。微型插条立即种植，无需任何额外处理。

每种处理的微型插条被种植在装有Carolina Soil?培养基的35立方厘米塑料管（30×85毫米）中，并在气候控制的温室中（20–30°C；相对湿度≥80%，通过喷雾提供）中维持50天。在最初的40天内，上方保持50%的遮阳网，高度为40厘米。

这段时间过后，幼苗被转移到一个有50%遮阳的遮荫房中，再持续40天，并使用自动喷灌系统。在此阶段，每周交替三天进行施肥，使用的营养液含有硝酸钙（92克/升）、硝酸钾（20克/升）、磷酸一铵（9.6克/升）、氯化钾（24克/升）、硫酸镁（30.7克/升）、螯合铁（4克/升）、硼酸（0.028克/升）、钼酸钠（0.004克/升）、硫酸锌（0.048克/升）和硫酸锰（0.112克/升）。

存活90天后，评估了幼苗的存活率（%）和幼苗高度（SH，厘米）。

**实验设计**

在第一个实验中，为每个克隆（C-1和C-2）建立了2×3因子设计（两种气体交换率×三种蔗糖浓度），每种处理有四个重复。每个重复包含一个培养容器，视为一个实验单元，其中含有四个外植体。在第二个实验中，采用了2×4因子设计（两个克隆C-1和C-2×四种光源），同样有四个重复，每个重复对应一个含有四个外植体的容器。对于体外存活阶段，只使用长度≥1.5厘米的微型插条，每种处理有四个重复，每个重复包含八株植物，总共每种处理32株植物。

对于所有评估的变量，使用R软件版本3.4（R Development Core Team，2018）和ExpDes.pt包进行统计分析。数据经过方差分析（ANOVA），残差的正态性使用Shapiro–Wilk检验在5%的显著性水平下进行评估。当检测到显著效应时，使用Tukey检验在5%的概率水平下比较处理均值。在因子实验中，检查了交互效应，并在生物学上相关的情况下分解交互项，即使因子之间的交互作用没有统计学显著性，以便更清晰地解释处理效应。

**结果**

**实验I：气体交换和蔗糖浓度**

使用15克/升的蔗糖有利于微型插条的发育和生产力（≥1.5厘米且<2.0厘米，以及≥2.0厘米）。在没有多孔膜的情况下（CO?交换率为14 μL L?1 s?1），与30克/升的蔗糖相比获得了更高的平均值，仅在C-1克隆的≥2.0厘米的微型插条中未观察到差异（图3a–d）。

**图3**

不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1 s?1）和蔗糖浓度（0、15和30克/升）下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）在体外培养30天后的生长参数。长度≥1.5厘米且<2.0厘米的微型插条数量（a，b）。长度≥2.0厘米的微型插条数量（c，d）。叶片鲜重（e，f）。叶片干重（g，h）。茎干鲜重（i，j）。茎干干重（k，l）。大写字母比较不同气体交换率之间的均值，小写字母比较不同蔗糖浓度之间的均值。相同字母后的均值在5%的概率水平下根据Tukey检验没有差异。数值代表均值（n = 4）±标准误差。

在较高蔗糖浓度下，膜的存在也增加了两个克隆的叶片鲜重，C-1克隆在所有蔗糖浓度下都观察到差异，而C-2克隆仅在最高浓度下观察到差异（图3e，f）。茎干鲜重的反应类似，在没有膜的情况下增加，在提供15克/升蔗糖时达到最高均值（图3i，j）。

对于叶片干重，膜的存在（CO?交换率为25 μL L?1 s?1）结合增加的蔗糖浓度有利于生物量的积累（图3g，h）。相比之下，对于茎干干重，无论膜的存在与否，较高蔗糖浓度都导致C-1克隆的最高均值（图3k，l）。

蔗糖的缺失对所有体外生长参数产生了负面影响，导致最低值，除了叶片和茎干干重外，其他所有性状都观察到显著交互作用。

**代谢活性和体外光合作用**

在较高气体交换率下，所有分析的主要代谢变量都增加了，特别是在与15克/升蔗糖结合时，这取决于所评估的克隆（图4）。

对于叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素（图4a–f）和类胡萝卜素（图4i，j），观察到因子之间的显著交互作用。在较高气体交换率下，无论是否有膜，两个克隆的色素含量都显著增加。只有在C-1克隆中，无蔗糖培养基且在膜存在的情况下，叶绿素a的含量较低。对于其他色素，无蔗糖条件下的色素含量与较高气体交换率下30克/升蔗糖条件下的含量没有差异。相反，在较低气体交换率下，随着蔗糖浓度的增加，色素含量逐渐增加。

在较高气体交换率下，两个克隆的光合速率都增加了，特别是在提供15克/升蔗糖的情况下（图4g，h）。在没有膜的情况下，蔗糖增加了光合值，而对于C-1和C-2两个克隆，蔗糖的缺失降低了光合活性。在较高气体交换条件下，光合作用也随着叶绿素含量的增加而增加。对于C-1克隆检测到因子之间的交互作用，而对于C-2克隆，因子作用是独立的。

**图4**

不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1 s?1）和蔗糖浓度（0、15和30克/升）下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）在体外培养30天后的叶绿素a浓度（a，b）、叶绿素b（c，d）、总叶绿素（e，f）、体外光合活性（g，h）、类胡萝卜素（i，j）和淀粉含量（k，l）。大写字母比较不同气体交换率之间的均值，小写字母比较不同蔗糖浓度之间的均值。相同字母后的均值在5%的概率水平下根据Tukey检验没有差异。FM = 新鲜质量。数值代表均值（n = 4）±标准误差。

在较高气体交换率下，淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖浓度增加（图4k和l以及5a–f）。在两种气体交换条件下，培养基中的淀粉和可溶性糖随着蔗糖浓度的增加而增加。对于C-1克隆，所有糖类都观察到因子之间的显著交互作用；然而，在C-2克隆中，仅观察到淀粉和果糖之间的交互作用，而葡萄糖和蔗糖的反应是独立的。

对于酚类、苹果酸、富马酸、脯氨酸、总氨基酸和蛋白质含量，观察到气体交换和蔗糖浓度之间的交互作用。对于酚类、苹果酸和富马酸，较高气体交换显著增强了代谢物浓度，而蔗糖在两种气体交换条件下都促进了浓度的逐渐增加（图5g–l）。

**图5**

不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1 s?1）和蔗糖浓度（0、15和30克/升）下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）在体外培养30天后的葡萄糖浓度（a，b）、果糖（c，d）、蔗糖（e，f）、酚类化合物（g，h）、苹果酸（i，j）和富马酸（k，l）。大写字母比较不同气体交换率之间的均值，小写字母比较不同蔗糖浓度之间的均值。相同字母后的均值在5%的概率水平下根据Tukey检验没有差异。FM = 新鲜质量。数值代表均值（n = 4）±标准误差。

在较高气体交换率下，脯氨酸、总氨基酸和蛋白质含量也显著增加，同时随着蔗糖可用性的增加而增加，在有膜的情况下观察到明显的增加（图6a–f）。在较低的气体交换率下，无论蔗糖浓度如何，两个克隆中的脯氨酸含量以及克隆C-1中的总氨基酸含量都没有差异；而克隆C-2中的总氨基酸含量和两个克隆中的蛋白质含量随着培养基中蔗糖浓度的增加而略有上升。超氧化物歧化酶活性在两个克隆中因处理方式的不同而有所差异。超氧化物歧化酶（SOD）活性（图6g, h）在较高气体交换率下最高，并且随着蔗糖浓度的增加而增加；而在没有膜的情况下，仅在无蔗糖处理中观察到差异。

图6
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脯氨酸浓度（a, b）、总氨基酸（c, d）、蛋白质含量（e, f）、与氧化应激相关的超氧化物歧化酶（SOD）活性（g, h）、试管培养30天后Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）的幼苗存活率（i, j）以及幼苗高度（k, l），在不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1 s?1）和蔗糖浓度（0, 15和30 g L?1）下。大写字母比较不同气体交换率之间的平均值，小写字母比较不同蔗糖浓度之间的平均值。根据Tukey检验，在5%的概率水平上，相同字母后的平均值没有差异。FM = 新鲜质量。数值代表平均值（n = 4）±标准误差。

解剖学特征
在无蔗糖且气体交换率较高的条件下，观察到叶片叶片的形态变化。组织学切片显示，较低的气体交换率和缺乏蔗糖导致栅栏组织和海绵组织的紧密度增加，从而减少了两个克隆中的细胞间隙。当在无蔗糖条件下应用较高气体交换率时，这种紧密度减弱，观察到正常的形态组织得到恢复。在蔗糖浓度为15和30 g L?1时，未检测到显著的解剖学变化（图7）。

图7
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在不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1 s?1）和蔗糖浓度（0, 15和30 g L?1）下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）的叶脉和叶肉的横截面，用甲苯胺蓝染色。缩写：Ad = 上表皮；Pp = 栅栏组织；Sp = 海绵组织；Ab = 下表皮；? = 气孔；Co = 厚角组织；Xy = 木质部；Ph = 韧皮部；Fp = 基本组织；Bs = 茎鞘；Is = 细胞间隙；Ss = 新生油分泌毛。比例尺 = 200 μm。

试管培养中微插条的存活率和幼苗高度
在含有15 g L?1蔗糖的培养基中微繁殖的幼苗，在90天时的存活率和高度都更优，无论气体交换率如何，尽管在较高气体交换率下观察到的数值更高。在存在透气膜的情况下，无蔗糖培养基和30 g L?1蔗糖对幼苗存活率没有差异；而在较低气体交换率下，无蔗糖培养基导致的存活率最低（图6i, j）。
对于幼苗高度也观察到了类似的模式，除了克隆C-2，在两种气体交换率下，30 g L?1蔗糖下的高度最低（图6k和l以及图8）。在较高气体交换率下，当提供15 g L?1蔗糖时，克隆C-1和C-2的幼苗存活率分别增加了两倍和三倍（图6i, j）。

图8
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在不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1）和蔗糖浓度（0, 15和30 g L?1）下，经过30天试管培养后的Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）的代表性微繁殖幼苗，在苗圃中90天时的情况。比例尺 = 4 cm。

实验II：光照质量的影响
所有试管生长参数都受到不同光照质量的影响，两个克隆的所有生长变量都观察到了因素之间的显著交互作用和基因型依赖的响应（图9a–f）。在白色LED光下，≥1.5 cm且<2.0 cm的微插条数量减少，而蓝色LED和红/蓝LED（3:1）分别使克隆C-1和C-2的微插条产量最高，其他光照质量之间没有差异（图9a）。
蓝色LED光增加了≥2.0 cm微插条的产量，尽管对于克隆C-1来说，它与荧光灯没有差异。相比之下，在红/蓝LED（3:1）下，克隆C-2的平均值最低，与荧光灯没有显著差异。对于克隆C-1，红/蓝LED（3:1）与白色LED没有差异（图9b）。

图9
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在不同光照质量下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）经过30天试管培养后的生长参数。FL = 荧光灯；WL = 白色LED；RL/BL（3:1）= 红/蓝LED（3:1）；BL = 蓝色LED。≥1.5 cm且<2.0 cm的微插条数量（a）。≥2.0 cm的微插条数量（b）。叶片新鲜质量（c）。叶片干质量（d）。茎新鲜质量（e）。茎干质量（f）。与氧化应激相关的超氧化物歧化酶（SOD）活性（g）。90天后的存活率（h）。幼苗高度（i）。大写字母比较不同克隆之间的平均值，小写字母比较不同光照质量之间的平均值。根据Tukey检验，在5%的概率水平上，相同字母后的平均值没有差异。数值代表平均值（n = 4）±标准误差。
对于克隆C-1，红/蓝LED（3:1）下叶片新鲜质量和叶片干质量都增加了，与荧光灯没有差异，而荧光灯与蓝色LED也没有差异。在克隆C-2中，只有红/蓝LED（3:1）增加了叶片新鲜质量，而叶片干质量与白色LED没有差异。白色LED降低了两个克隆的叶片新鲜质量和干质量；然而，对于克隆C-1，这些数值与蓝色LED下的数值没有差异（图9c, d）。
对于茎新鲜质量，红/蓝LED（3:1）促进了两个克隆的生物量积累，而白色LED降低了克隆C-1的数值，但与蓝色LED没有差异。在克隆C-2中，其他光照处理之间没有差异（图9e）。在白色LED下，两个克隆的茎干质量都受到负面影响，尽管在克隆C-2中，它与蓝色LED没有显著差异。红/蓝LED（3:1）增加了两个克隆的茎干质量；然而，对于克隆C-1，它与荧光灯或蓝色LED没有显著差异（图9f）。

超氧化物歧化酶活性
对于超氧化物歧化酶（SOD），观察到因素之间的显著交互作用。在克隆C-1中，蓝色LED光下检测到最高的SOD活性，与白色LED没有显著差异，而其他光照处理之间没有差异。相比之下，在克隆C-2中，蓝色LED光导致最低的SOD活性，与红/蓝LED（3:1）没有显著差异，其他光照处理之间也没有差异（图9g）。

解剖学特征
在两个克隆中，红/蓝LED（3:1）在视觉上增加了细胞间隙，同时减少了叶肉中的海绵组织程度。相比之下，蓝色LED光增加了栅栏组织和海绵组织的紧密度，显著减少了细胞间隙。荧光灯诱导的叶肉层比其他光照质量更薄（图10）。

图10
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在不同光照质量下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）经过30天试管培养后的叶脉和叶肉的横截面，用甲苯胺蓝染色。FL = 荧光灯；WL = 白色LED；R/B L（3:1）= 红/蓝LED（3:1）；BL = 蓝色LED。缩写：Ad = 上表皮；Pp = 栅栏组织；Sp = 海绵组织；Ab = 下表皮；? = 气孔；Co = 厚角组织；Xy = 木质部；Ph = 韧皮部；Fp = 基本组织；Bs = 茎鞘；Is = 细胞间隙。比例尺 = 200 μm。

试管培养中微插条的存活率和幼苗高度
通过在含有15 g L?1蔗糖的培养基中微繁殖，90天时的幼苗存活率和高度都得到了改善，无论气体交换率如何，尽管在较高气体交换率下观察到的数值更高。在存在透气膜的情况下，无蔗糖培养基和30 g L?1蔗糖在幼苗存活率方面没有差异；而在较低气体交换率下，无蔗糖培养基导致的存活率最低（图6i, j）。
对于幼苗高度也观察到了类似的模式，除了克隆C-2，在两种气体交换率下，30 g L?1蔗糖下的高度最低（图6k和l以及图8）。在较高气体交换率下，当提供15 g L?1蔗糖时，克隆C-1和C-2的幼苗存活率分别增加了两倍和三倍（图6i, j）。

图8
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在不同气体交换率（CO?为14和25 μL L?1）和蔗糖浓度（0, 15和30 g L?1）下，经过30天试管培养后的Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）在苗圃中90天时的代表性微繁殖幼苗。比例尺 = 4 cm。

实验II：光照质量的影响
所有试管生长参数都受到不同光照质量的影响，两个克隆的所有生长变量都观察到了因素之间的显著交互作用和基因型依赖的响应（图9a–f）。在白色LED光下，≥1.5 cm且<2.0 cm的微插条数量减少，而蓝色LED和红/蓝LED（3:1）分别使克隆C-1和C-2的微插条产量最高，其他光照质量之间没有差异（图9a）。
蓝色LED光增加了≥2.0 cm微插条的产量，尽管对于克隆C-1来说，它与荧光灯没有差异。相比之下，在红/蓝LED（3:1）下，克隆C-2的平均值最低，与荧光灯没有显著差异。对于克隆C-1，红/蓝LED（3:1）与白色LED没有差异（图9b）。

图9
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在不同光照质量下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）经过30天试管培养后的生长参数。FL = 荧光灯；WL = 白色LED；RL/BL（3:1）= 红/蓝LED（3:1）；BL = 蓝色LED。≥1.5 cm且<2.0 cm的微插条数量（a）。≥2.0 cm的微插条数量（b）。叶片新鲜质量（c）。叶片干质量（d）。茎新鲜质量（e）。茎干质量（f）。与氧化应激相关的超氧化物歧化酶（SOD）活性（g）。90天后的存活率（h）。幼苗高度（i）。大写字母比较不同克隆之间的平均值，小写字母比较不同光照质量之间的平均值。根据Tukey检验，在5%的概率水平上，相同字母后的平均值没有差异。数值代表平均值（n = 4）±标准误差。
对于克隆C-1，红/蓝LED（3:1）下叶片新鲜质量和叶片干质量都增加了，与荧光灯没有差异，而荧光灯与蓝色LED也没有差异。在克隆C-2中，只有红/蓝LED（3:1）增加了叶片新鲜质量，而叶片干质量与白色LED没有差异。白色LED降低了两个克隆的叶片新鲜质量和干质量；然而，对于克隆C-1，这些数值与蓝色LED下的数值没有差异（图9c, d）。
对于茎新鲜质量，红/蓝LED（3:1）促进了两个克隆的生物量积累，而白色LED降低了克隆C-1的数值，但与蓝色LED没有差异。在克隆C-2中，其他光照处理之间没有差异（图9e）。在白色LED下，两个克隆的茎干质量都受到负面影响，尽管在克隆C-2中，它与蓝色LED没有显著差异。红/蓝LED（3:1）增加了两个克隆的茎干质量；然而，对于克隆C-1，它与荧光灯或蓝色LED没有显著差异（图9f）。

超氧化物歧化酶活性
对于超氧化物歧化酶（SOD），观察到因素之间的显著交互作用。在克隆C-1中，蓝色LED光下检测到最高的SOD活性，与白色LED没有显著差异，而其他光照处理之间没有差异。相比之下，在克隆C-2中，蓝色LED光导致最低的SOD活性，与红/蓝LED（3:1）没有显著差异，其他光照处理之间也没有差异（图9g）。

解剖学特征
在两个克隆中，红/蓝LED（3:1）在视觉上增加了细胞间隙，同时减少了叶肉中的海绵组织程度。相比之下，蓝色LED光增加了栅栏组织和海绵组织的紧密度，显著减少了细胞间隙。荧光灯诱导的叶肉层比其他光照质量更薄（图10）。

图10
全尺寸图像
在不同光照质量下，Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）经过30天试管培养后的叶脉和叶肉的横截面，用甲苯胺蓝染色。FL = 荧光灯；WL = 白色LED；R/B L（3:1）= 红/蓝LED（3:1）；BL = 蓝色LED。缩写：Ad = 上表皮；Pp = 栅栏组织；Sp = 海绵组织；Ab = 下表皮；? = 气孔；Co = 厚角组织；Xy = 木质部；Ph = 韧皮部；Fp = 基本组织；Bs = 茎鞘；Is = 细胞间隙。比例尺 = 200 μm。

试管培养中微插条的存活率和幼苗高度
通过试管（苗圃）条件下的幼苗存活率和高度来评估微插条的存活率，这取决于微繁殖期间使用的光照质量。与白色LED光相比，荧光灯在90天后使两个克隆的存活率显著提高，并且幼苗高度更大（图9h, g和图11）。与白色LED相比，荧光灯使幼苗存活率增加了九倍。

图11
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在不同光照质量下经过30天试管培养后获得的微插条种植的Corymbia torelliana × C. citriodora克隆（C-1和C-2）在苗圃中90天时的适应植物。缩写：FL = 荧光灯；WL = 白色LED；R/BL（3:1）= 红/蓝LED（3:1）；BL = 蓝色LED。比例尺 = 4 cm。

讨论
试管环境中的变化调节了微繁殖植物的生长、发育和代谢。本研究证明，结合较低气体交换率和15 g L?1蔗糖存在的条件有利于繁殖体的产量，而蔗糖的可用性促进了新鲜叶片和茎干生物量的增加。
降低气体交换限制了CO?的流入，并且更重要的是，增加了培养环境内的相对湿度（Alves等人2024；Kozai等人2005），使微繁殖植物在其组织中积累了更多的水分。此外，蔗糖作为植物生长的丰富且易于获得的能量来源（Nguyen等人2020；Kozai 2010），增强了植物固定CO?的能力（Badr等人2015）。有了充足的水分和能量，植物将资源分配到增加的茎梢增殖和茎梢伸长上。相反，采用较高气体交换率的系统促进了叶片和茎干中干生物量的积累，这可能是由于较低湿度环境有利于较不湿润的组织。Batista等人（2017）也报告了在增强气体交换条件下干质量的类似增加。
增加气体交换显著提高了光合色素含量和试管光合活性。先前的研究报道，在较高气体交换条件下，Ananas comosus（Alves等人2024）、Vernonia condensata（Fortini等人2021）和Capsicum annuum（Batista等人2017）也表现出叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量的增加。具有较高CO?水平的试管环境已被证明可以促进与叶绿素代谢和生物合成相关的基因表达，从而促进光合作用并提高光合效率（Song等人2020；Xu等人2020）。相比之下，通风不良的试管系统倾向于积累乙烯（Nguyen等人2020），乙烯是叶绿素降解的重要诱导剂（Li等人2023b）。
试管光合作用的减少也可能由于培养基中蔗糖浓度的增加而发生（图4h）。在较高蔗糖水平下，已报道Ananas comosus（Alves等人2024）和Eryngium foetidum（Silva等人2024）的光合能力降低。蔗糖的可用性增加通过蔗糖积累与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的酶活性之间的反馈调节，负面影响了净CO?同化（Desjardins等人1995；Lobo等人2015）。
具有较高CO?可用性的环境还与植物中淀粉和可溶性糖的积累增加有关（Dong等人2018；Gámez等人2020），这与本研究的发现一致。由CO?可用性增加驱动的光合作用增强导致Phaseolus vulgaris叶片中淀粉和可溶性糖的显著积累，这与蔗糖-磷酸合成酶（SPS）和腺苷5′-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）的主要酶的活性增加有关（Prasad等人2004）。
透气膜的存在也增加了本研究中苹果酸、富马酸、脯氨酸、总氨基酸和蛋白质的浓度。据报道，在CO?可用性增加的条件下，小麦籽粒和颖壳中苹果酸和总蛋白质的合成得到了增强（Gámez等人2020）。在有氧条件（+ CO?）和淀粉供应下，实现了高效的酶级联反应，使苹果酸产量提高了95%（Shi等人2019），随后苹果酸被脱水并转化为富马酸（Takeuchi和Amao 2023）。
脯氨酸和其他氨基酸被广泛记录为参与植物对脱水的保护，在水分有限条件下生长时在植物组织中大量积累（Verslues和Sharma 2010）。这与这里获得的结果一致，因为透气膜的存在通过允许与外部环境更大的气体交换，从而也促进了植物生长培养基的脱水。
脯氨酸和其他氨基酸的增加可能反映了与生理压力相关的代谢反应。脯氨酸的积累被广泛认为是细胞脱水或氧化应激条件下的保护性反应，作为渗透保护剂和蛋白质及膜的稳定剂（Verslues和Sharma 2010）。类似地，酚类化合物也是抗氧化防御系统的一部分，有助于减轻活性氧（ROS）造成的损伤（Apel和Hirt 2004）。因此，这些代谢物浓度的增加可能表明植物在体外培养过程中经历了一定程度的生理压力。然而，这些代谢调整也可能代表在次优条件下支持植物生长的适应性反应。在本研究中，尽管与压力相关的代谢物有所增加，但植物表现出正常的发育和成功的体外适应，这表明这些生化变化有助于生理调整，而不是表明有害的压力。因此，观察到的代谢反应可能反映了压力信号传导和适应性代谢调节之间的平衡，促进了植物从体外到体外环境的过渡。在膜的存在下，超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性增加（图6g, h）。这种酶浓度的增加可能与在富二氧化碳环境中诱导的氧化应激有关。根据Fortini等人（2021）的研究，增加蔗糖浓度和增强气体交换也会促进酚类含量的提高，这在当前研究中也有类似的观察结果。二氧化碳可用性的提高通过光合作用增强了碳的同化，从而可能改变光合产物的分配方向，进而增加总抗氧化能力（Austen等人2019；Dong等人2018）。在较高气体交换条件下对Corymbia torelliana × C. citriodora进行微繁殖时，特别是在使用15克/升蔗糖的情况下，植物的体外存活率和植株高度有所增加（图6i-l）。如先前报道的，与外部环境增强气体交换可以增加中等蔗糖浓度下的光合色素含量和体外光合作用，从而促进植物对体外环境的适应。在Ananas comosus中，使用透气膜并将蔗糖浓度降低到10克/升也提高了植物的体外存活率（Alves等人2023）。缺乏蔗糖导致最低的存活率和植株高度；然而，在膜的存在下，这些值与最高蔗糖浓度下的值没有差异。值得注意的是，使用30克/升蔗糖时产生了分叉的植株（图8）。在评估的杂交品种的微繁殖过程中应用的不同光照质量对植物的生长和发育有显著影响，表明克隆对相同的光照刺激可能有不同的反应。尽管生长参数之间存在变异性，蓝光促进了两个克隆中≥2厘米的微插条数量增加，而红/蓝光（3:1）则增加了生物量的积累。在Achillea millefolium中，蓝光条件下获得了更长的茎长（Alvarenga等人2015）。蓝光也被推荐用于茎的再生（Gupta和Karmakar 2017）以及作为叶绿素合成的刺激剂（Gupta和Karmakar 2017；Hoffmann等人2015），这可能与在蓝光下微繁殖的植物茎生长增强有关。在Lippia rotundifolia中，红光光谱与蓝光结合使用增加了生物量的积累，这种反应与植物对这种光谱组成的更高光敏性有关（Hsie等人2019）。同样，在Pfaffia glomerata中，红/蓝光以1:1的比例组合有利于生物量的积累（Silva等人2020）。同样的光照比例也增加了Populus euramericana的细胞分裂，从而促进了生物量的积累（Kwon等人2015）。在测试的不同光照质量和克隆之间观察到了抗氧化反应的广泛差异。克隆C-2在蓝光下的超氧化物歧化酶（SOD）活性较低，而克隆C-1在同一光照条件下显示出最高的SOD活性（图9g）。在光照压力条件下，植物倾向于吸收更多的光进行光合作用，过量的激发能量可能导致光抑制和活性氧（ROS）的生成。为了对抗这些效应，植物增强了其抗氧化能力（Shao等人2020）。光照质量被证明是评估克隆体外存活的关键因素。荧光光对两个克隆的存活和植株发育最为适宜。对于Eucalyptus saligna、E. microcorys、E. pilularis和Corymbia torelliana的克隆，也有类似的存活/生根反应报告（Souza等人2022）。与其他在白光LED下表现更好的物种不同（Batista等人2018），这里评估的Corymbia杂交品种在荧光光下表现出更好的体外发育和存活率，在白光LED下表现最差。本研究中使用的荧光光源具有宽广的光谱范围，涵盖380至680纳米的波长，具有较低的连续辐照峰值和更大的光谱多样性（图2）。这种更宽的光谱幅度和减弱的辐照峰值可能有助于提高体外存活率。在荧光光下观察到的更高体外存活率可能与其更宽广和更平衡的光谱分布有关，这可能促进更好的光合作用、叶片解剖结构和功能性气孔活动。这些特性改善了植物在从体外生长条件向体外自养生长过渡期间的生理能力。正如所展示的，遗传背景、气体交换条件、蔗糖水平和光照质量是植物组织培养中变异的主要来源，会引起形态学、解剖学和生理变化。因此，在植物微繁殖过程中应特别关注这些因素，正如本研究中评估的Corymbia torelliana × C. citriodora两个杂交克隆所证明的那样。

结论：在气体交换率为25微升/升·秒、培养基中含15克/升蔗糖的体外环境中，Corymbia torelliana × C. citriodora两个杂交克隆的茎生长和发育得到了促进，表现出体外光混合营养行为。使用透气膜增强了光合作用和代谢活动，提高了超氧化物歧化酶活性，并提高了获得的微插条的体外存活率，以及产生的植株的生长。蓝光谱对于体外延长微插条最为有效；然而，在微繁殖过程中使用的荧光光在塑料管中种植90天后促进了植株的更好存活率，与白光LED相比，植株存活率增加了九到十五倍。使用透气膜，结合15克/升的蔗糖以及基于荧光灯、蓝光LED和红/蓝LED（3:1）的照明系统，对于Corymbia杂交品种的微繁殖和随后的成功适应非常有效。结果表明，所评估的基因型通过组织培养进行大规模克隆繁殖和有效的体外生产具有未充分探索的潜力。因此，所提出的方案为潜在的商业应用提供了有希望的前景，有助于推进繁殖技术的发展，以及针对Corymbia物种的生物技术策略的开发。