《The FASEB Journal》：Human α2-Macroglobulin: Architecture, Mechanisms, and Functional Implications
人α2-巨球蛋白（hα2M）是一种大型糖蛋白，属于脊椎动物血浆和无脊椎动物血淋巴中最丰富的蛋白质之一。它在先天免疫系统中扮演多重角色，既是广谱蛋白酶抑制剂，又参与细胞因子和激素转运，还能触发多种细胞反应，对真核生物和部分原核生物系统的功能至关重要。本文聚焦于人α2-巨球蛋白（hα2M）分子，汇总了其结构与独特的蛋白酶捕获机制的最新研究，回顾了50年来关于hα2M的文献积累，探讨了其独特的电泳行为、二聚体形式、在炎症环境中的潜在作用以及蛋白酶捕获的基本单元。同时总结了hα2M结构研究面临的挑战、非蛋白水解配体的独特掺入机制，以及纯化与储存的要点。尽管目前hα2M的临床应用主要局限于作为某些疾病的次要生物标志物，但在过去十年中，新的治疗方法已开始初步探索。hα2M的研究对于理解先天免疫系统的未知方面、开发新疗法、阐明感染和炎症过程、探索癌症耐药性的潜在联系以及推动转化和临床研究的其他关键领域仍具有重要意义。
发现、功能与hα2M的进化同源物
人α2-巨球蛋白（hα2M）最早于1946年被描述，当时Cohn及其同事通过乙醇沉淀法分离血浆时被识别，并被分为五个组分。大部分hα2M位于III组分中，与免疫球蛋白M（IgM）和A（IgA）共存。直到1955年左右，Jacobsson、Schultze及其合作者的工作才将其完全分离。自hα2M被分离以来，大量研究对其结构、作用机制、生物学功能和潜在临床应用进行了表征。
hα2M是一种在血浆中生理浓度范围为2至4 mg/mL的大型糖蛋白。它主要由哺乳动物肝脏的肝细胞产生，但也由巨噬细胞、成纤维细胞、单核细胞和星形胶质细胞合成。作为一种急性期蛋白，其表达受促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）的正向调控，并且hα2M还能结合IL-6，形成负反馈回路。IL-6依赖的Janus激酶（JAK）信号激活信号转导和转录激活因子3（STAT3），后者结合hα2M启动子并促进转录。
hα2M主要贡献于先天免疫系统，其核心功能是抑制蛋白酶，包括内源性和外源性肽酶。hα2M能够抑制所有四类肽酶——丝氨酸、半胱氨酸、金属肽酶和天冬氨酸蛋白酶——使其成为独特的广谱蛋白酶抑制剂。因此，hα2M是血液中关键的生理调节剂，参与炎症、宿主免疫防御和对感染的反应。它还调节凝血相关肽酶（例如，抑制凝血酶、纤溶酶、因子Xa、激肽释放酶、尿激酶和活化蛋白C），从而发挥抗凝和抗纤溶作用，保护自身组织免受蛋白水解损伤。除了公认的蛋白酶捕获作用外，hα2M还参与多种其他功能，如运输细胞因子、生长因子和激素（例如，FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-18、NGF-β、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、TNF-α、VEGF）。此外，它具有转谷氨酰胺酶活性，并结合锌和铜离子（尽管这些并非其抗蛋白水解活性的辅因子），其Holdase型分子伴侣活性可稳定错误折叠的蛋白质并促进其清除，防止在各种体内条件下形成聚集体。
hα2M表现出抗炎和抗凋亡特性，其失调与多种疾病相关，包括阿尔茨海默病、艾滋病、糖尿病和心血管疾病。目前，hα2M的临床应用仅限于作为上述部分疾病的次要生物标志物（例如，心肌肥厚和心肌梗死的早期标志物）。然而，基于其捕获蛋白酶和结合促炎细胞因子（例如，TNF-α、IL-1β和IL-6）的能力，已提出了多种潜在的临床应用。迄今为止，尚无证据支持hα2M完全缺失的情况，表明其对胚胎发育至关重要。孕妇中观察到浓度升高，可能是由雌激素诱导。值得注意的是，高浓度（例如，据报道孕妇吸烟者中）与胚胎发育减少有关。尽管这种关系可能是间接的，可能反映了吸烟生活方式导致的生物标志物水平改变。
作为防御系统（免疫系统）的关键进化组成部分，α2-巨球蛋白（α2M）在物种进化过程中得以保守。在人类分子的远亲中也发现了结构同源物，包括各种后生动物，甚至在原核细胞（如细菌）中也有发现。一个非确定性的假说提出，细菌的α2M是从后生动物宿主获得的，因为这些蛋白质主要存在于共生和致病性革兰氏阴性菌中，随后通过独立的水平基因转移事件传播到其他定殖细菌物种。
除了种间同源物外，hα2M与其他人类先天免疫分子具有显著的结构相似性，特别是补体蛋白如补体成分3-5（C3、C4、C5）。hα2M与妊娠区带蛋白（PZP）、α2-巨球蛋白样1（α2ML1）、α1-抑制剂-3（α1I3）、细胞表面抗原CD109（CD109）以及C3和PZP样α2-巨球蛋白结构域包含蛋白8（CPAMD8）共同构成了硫酯蛋白（TEP）家族，该家族大致分为两类：蛋白酶抑制剂和补体因子。TEP家族蛋白的进化起源可追溯至6亿多年前——早于免疫球蛋白。已知最早的α2M大约出现在5亿年前，存在于马蹄蟹Limulus polyphemus的血淋巴中。一个假说认为C3蛋白起源于α2M的基因复制事件，随后产生了C4和C5蛋白。因此，推测不同物种的所有α2M同源物都源自一个共同的祖先，具有由八个同源结构域组成的保守核心结构。测序分析和外显子-内含子组织研究支持了这一点，揭示了不同α2M同源物与补体系统蛋白之间的结构相似性。在回顾了其发现、功能和同源物之后，接下来将探讨hα2M从单体到四聚体的组织结构以及产生可靠三维模型的挑战。
从单体到四聚体：hα2M的结构复杂性与建模挑战
3.1 hα2M单体的二级和三级结构
hα2M是一种720 kDa的糖基化同四聚体蛋白，包含四个相同的180 kDa单体。每个单体包含1451个氨基酸残基（包括信号肽为1474个），并具有11个分子内和2个分子间二硫键。此外，单体被组织成11个结构域。hα2M被描述为“二聚体的二聚体”，因为每个单体与其相邻单体形成两个二硫键，但上下两个二聚体之间没有共价连接。
前七个结构域被称为巨球蛋白样结构域（MG1-MG7），具有结构功能，排列为七个反平行β-三明治，每个结构域约含110个残基。接下来，补体C1r/C1s、Uegf、Bmp1结构域或互补结构域（CUB）连接到MG7、RBD和TED，包含116个残基，由两个β-折叠组成，每个折叠由四条反平行链构成。硫酯结构域（TED）通过其N端和C端与CUB结构域的β3和β4环相连。它包含315个残基，排列成盘状，由六对α-螺旋围绕中心轴组成；此外，它还具有一个连接α-螺旋9（α9）和α-螺旋10（α10）的β-折叠片。受体结合结构域（RBD），也称为MG8，因其结构相似性而得名，位于hα2M单体的C端区域。RBD连接在CUB结构域后方，在hα2M的天然形式中被内化。它由129个残基组成，采用类似于MG β-三明治的构象，具有九个反平行链，排列成四链和五链片层。此外，它包含一个额外的α-螺旋和β-α-β单元。
最后一个结构域称为诱饵区结构域（BRD），包含127个残基，是位于MG6第四和第五β-链之间插入的延伸且灵活的部分。在单体的天然形式中，它位于单体的内部区域，占据hα2M单体内部空腔的垂直维度的很大空间，并与MG1、MG3和MG5相互作用。它包含一个39个残基的诱饵氨基酸序列——也称为诱饵区（BR）——被底物切割后，会触发hα2M同四聚体的重大构象变化，这与蛋白酶捕获和陷阱机制直接相关。
最近的研究将BRD分为两部分：连接区（LNK）和BR。LNK在α2M蛋白超家族（α2MF）的同源物中是保守的。据推测，它是hα2M二聚体之间的非共价相互作用界面，对应于BRD的静态部分。相反，与LNK和MG6相互作用的移动区域负责hα2M在BR不稳定后的主要构象变化。这一机制假说被称为“插件通道（plug-in-channel）”，尚未得到完全证实。然而，对其研究开启了对hα2M在蛋白酶捕获机制期间构象重排的分子触发因素的理解。
前六个结构域（MG1-MG6）形成一个紧凑的、一圈半的右旋超螺旋椭球超级结构域，构成单体中被称为“基底臂（base arm）”的静态区域。MG7结构域关闭超螺旋，并作为连接CUB、TED和RBD的铰链。这三个结构域与MG7一起构成单体的移动区域，统称为“摆动臂（swing arm）”。蛋白酶切割39个残基的BRD区域会诱导重大的构象变化，移动“摆动臂”，将RBD暴露在分子的外表面。因此，这不仅导致单体内部，而且在整个hα2M四聚体中，结构域之间的角度、扭转和距离发生显著变化。相比之下，“基底臂”在此构象变化期间基本保持静态。在剖析了hα2M单体的二级和三级结构后，现在考虑其四级组织，正如最近的三维研究所进一步完善的那样。
3.2 四级结构：四聚体形式
Huang等人、Luque等人的近期工作提供了通过冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的hα2M四聚体天然和蛋白酶诱导形式的三维模型。此外，Marrero等人报告的第三个模型展示了甲基胺（MA）诱导形式的hα2M（hα2M-MA）的结构，同样通过cryo-EM解析。MA是一种小的亲核试剂，可触发类似于蛋白酶诱导的hα2M构象变化。这些四级结构，加上基于天然C3蛋白优化的hα2M模型，预测天然hα2M采用具有两个开放端的空心圆柱形结构，正如Feldman及其同事在1985年最初提出的那样。这与Sottrup-Jensen提出的模型形成对比，后者设想hα2M四聚体形成由细长杆状单体组成的十字形。
天然分子存在两种构象：一种单体间夹角较开放（天然I），另一种排列较闭合（天然II），尺寸为210 × 185 × 150 ?。相比之下，MA诱导（hα2M-MA）或蛋白酶诱导（hα2M-蛋白酶）的构象尺寸为140 × 210 × 140 ?。中间模型（具有一个、两个或三个“闭合”单体）也有报道。如前所述，除了其空心圆柱结构外，hα2M还表现出多个不同大小的侧面开口。天然状态包含四个大孔和四个小孔，分别约为70 × 50 ?和30 × 20 ?。相比之下，诱导形式显示出12个较小的开口，约为30 × 40 ?。这些侧面开口，即使在hα2M-MA中，也可能解释了长时间体外孵育后蛋白酶的掺入，因为BRD内的BR在整个转变过程中保持完整，从而允许能够接近BR的蛋白酶被捕获。然而，多项研究提出hα2M-MA采取“闭合”构象并完全丧失其抗蛋白水解活性。
这种孔径支持了Barret提出的hα2M在富含蛋白质血浆环境中作为“分子筛”的作用。根据该模型，未被hα2M捕获的蛋白酶可能（i）太大，导致空间位阻，无法进入内部BR；（ii）非常小（<10 kDa），允许它们在不发生相互作用的情况下穿过充满空腔的结构；或（iii）蛋白水解活性有限，不足以切割39个残基的BR。
hα2M-蛋白酶和hα2M-MA的三维结构显示出一些结构差异，正如Marrero等人报告的hα2M-MA模型和Huang等人报告的hα2M-蛋白酶模型的叠加所证明的那样。首先，这些差异主要是由于“猎物腔（prey chamber）”内蛋白酶底物的密度较高，这在hα2M-MA中不存在。其次，RBD的方向在这两种诱导形式之间存在差异，当被甲基胺等小的伯胺诱导时，RBD出现在较低位置。这种差异源于不同的构象变化机制；尽管两者都代表hα2M的诱导状态，但“摆动臂”的构象变化发生方式不同。随着hα2M四聚体通过最近的高分辨率模型得到解析，现在将讨论这些表示仅在近几十年才出现的原因。
3.3 hα2M三维结构建模的历史挑战
Barrett和Starkey提出的hα2M在蛋白酶捕获中的构象变化理论机制已经确立超过50年，但单个结构域的确切行为和四聚体分子的三维重组仍然是持续争论的主题。这一挑战源于hα2M的巨大尺寸和固有的灵活性，以及缺乏重组表达系统（最近才有描述），能够大规模生产均质的功能性蛋白质。此外，即使在高分辨率cryo-EM模型中，内化的BRD也难以可视化。另外，从天然来源纯化的样品中的结构异质性进一步使分析复杂化。
hα2M的第一个低分辨率结构模型是在1968年使用负染和早期cryo-EM技术获得的。随后的进展，包括带有三维图像重建的cryo-EM和低分辨率X射线晶体学，允许进行更详细的分析。然而，早期的观察结果主要局限于源自天然补体C3蛋白的同源模型，拟合到低分辨率cryo-EM图谱，蛋白酶陷阱机制的结构基础在很大程度上仍是推测性的。唯一可用的诱导构象模型来自Marrero等人，使用了小的亲核试剂MA，揭示的结构与蛋白酶诱导的结构相似但不相同。
2022年，两项高分辨率cryo-EM研究提供了hα2M的精细三维结构，涵盖了从天然状态到完全蛋白酶诱导状态（hα2M-蛋白酶）。除了这些模型外，Harwood等人提出了基于天然C3蛋白的优化模型；Nielsen等人报告了α2MF同源物α2ML1的cryo-EM结构；Arimura和Funabiki发表了Xenopus laevis卵母细胞同源物（α2Moo或卵巨球蛋白）的结构。这些研究为理解hα2M的结构以及蛋白酶捕获机制期间的单体动力学变化提供了更清晰的认识，证实了从1970年代到1990年代的机理和结构研究中提出的几个假说，这些假说往往仅仅是推测性的。
蛋白酶捕获机制
4.1 构象动力学、“猎物腔”和蛋白酶捕获化学计量
在对hα2M进行结构表征之后，讨论蛋白酶捕获的分子机制。近半个世纪前，Barrett和Starkey提出了hα2M蛋白酶陷阱机制，此后通过旨在验证或反驳该假说的各种研究和实验进行了广泛研究。然而，尽管发现了额外特征（如共价硫酯键），Barrett和Starkey的假说基本保持不变，并成为蛋白质机制表征领域最持久的模式之一。蛋白酶捕获机制在hα2M中被称为“捕蝇草（Venus flytrap）”，类似于食肉植物捕捉苍蝇，而一些单体同源物则采用“夹陷阱（snap-trap）”机制。简而言之，hα2M的蛋白酶捕获及随后的清除通过一系列步骤发生：（i）BRD内BR的蛋白水解切割；（ii）hα2M的构象变化；（iii）内部TED中硫酯键的切割以及与蛋白酶的共价连接；（iv）先前埋藏的RBD的暴露；（v）通过表达LRP1或CS-GRP78受体的细胞清除复合物。
为了更好地理解蛋白酶捕获机制，必须阐明单体的空间排列。参考单体与相邻单体形成非共价邻近二聚体，与另一个亚基形成共价二硫键连接的二聚体，并与位于其对面的相对单体相互作用。这里提到的参考单体与其邻近单体共同形成一个蛋白酶捕获区域。每个hα2M单体包含一个BR（BRD内的39个残基片段）；因此，四聚体分子拥有四个BR，但只有两个相互连接的蛋白酶捕获区域。最近的研究得出结论，hα2M采用中间构象，在捕获小蛋白酶时，单体独立于其二硫键连接的对应物而被诱导，如具有一个到三个诱导单体的中间体以及捕获单个胰蛋白酶的全诱导物种所示。这与提出的其他模型形成对比，后者假设所有四个hα2M单体同时转变。与蛋白酶相互作用后，底物蛋白酶对BR的水解触发该单体的构象变化；蛋白水解诱导的结构重排从一个单体传递到其他未切割的单体，导致四个单体处于诱导状态。在此步骤中，第二个快速作用的蛋白酶（例如，胰蛋白酶-hα2M结合时间：~0.05 s）可以达到相对二聚体诱饵的剩余区域，从而形成相对于hα2M的小蛋白酶2:1化学计量比。
该模型与Barrett和Starkey在1973年提出的蛋白酶捕获机制以及多项研究报告一致，即hα2M可以捕获两个小蛋白酶（2:1化学计量比；每个二聚体一个——例如，胰蛋白酶，~25 kDa）或一个大的蛋白酶（1:1），如纤溶酶（~90 kDa）。现在了解到，这种化学计量比与蛋白酶捕获期间四个单体相互作用形成的内部空腔的大小有关。这个被称为“猎物腔”的空腔容纳hα2M结构内的蛋白酶，估计体积在天然形式（捕获前）约为600 nm3，在诱导形式（捕获后）约为300 nm3。此外，该空腔还由每个单体凹形内部贡献的额外体积补充，称为“底物前室（substrate antechambers）”。由于hα2M分子具有相当大的结构灵活性，它能够容纳直径超过~60 ?的蛋白酶。
hα2M中存在四个BR并不意味着每个单体独立拥有蛋白酶捕获能力，也不意味着分离的二硫键连接的二聚体独立保留抗蛋白水解活性。由于蛋白酶捕获完全依赖于底物在两个邻近单体之间的空间捕获，这表明hα2M抗蛋白水解活性的基本单位是非共价连接的二聚体，这将在后面讨论。此外，需要切割BR，这意味着底物蛋白酶必须同时表现出催化活性和对39个残基BR序列的足够亲和力。正如先前基于hα2M捕获乙酰化赖氨酸残基胰蛋白酶能力的假说所预测的——不需要共价硫酯连接——这一概念后来被Harwood等人（2021年）的最新研究证实。作者生成了一个重组hα2M变体，其中39个残基的BR被13个重复的Gly-Gly-Ser序列取代，这是胰蛋白酶缺乏亲和力的底物序列。尽管维持了其天然构象和可被伯胺诱导性，这种修饰的hα2M未能捕获胰蛋白酶。
4.2 通过反应性硫酯（β-半胱氨酰-γ-谷氨酰）形成共价键
在BR被切割后，该机制的第二个阶段涉及蛋白酶与反应性硫酯键的共价连接，该键在hα2M被蛋白水解攻击触发的构象变化期间被破坏。在单体和二聚体同源物中，这是底物蛋白酶捕获的主要步骤，如PZP和α1I3所示。当这些TEP家族蛋白与破坏硫酯键的小伯胺一起孵育时，它们完全丧失其抗蛋白水解能力。相比之下，经伯胺处理的四聚体hα2M保留了结合蛋白酶的能力，尽管动力学较慢。
硫酯段由15个原子组成，在Cys949的巯基（-SH）和Gln952的羰基之间形成共价键，或者在考虑23个氨基酸的信号肽时，位于残基972-975（基序C972-G973-E974-Q975）。这个反应性键埋藏在TED内部。此外，该键受到TED和RBD内周围芳香族和疏水残基的保护，形成一个保护性疏水口袋。硫酯键切割后，谷氨酰胺的高反应性羰基受到捕获蛋白酶中赖氨酸残基的亲核胺的攻击，导致hα2M和底物蛋白酶之间形成共价连接的ε-赖氨酰-γ-谷氨酰加合物。然而，这种相互作用不仅仅是简单的锚定事件；蛋白酶分子相对于hα2M结构以不同的方向共价连接，并且可能形成多个共价键，这取决于它们的分子大小和与邻近单体上的额外硫酯位点的空间接近程度。
除了由hα2M构象变化触发的硫酯切割外，小的伯胺也可以诱导硫酯断裂，导致hα2M四聚体的结构转变类似于蛋白酶捕获期间观察到的转变。小分子如甲基胺、乙基胺和铵离子对硫酯键表现出更高的反应性，而较大的胺——如正丁胺、异丁胺或二甲胺——由于疏水口袋施加的空间位阻，对反应位点的可及性降低。此外，小伯胺的掺入不仅取决于其分子大小，还取决于反应介质的pH。较高的pH值增强胺的掺入；然而，pH高于9可能会损害hα2M的结构完整性。
β-半胱氨酰-γ-谷氨酰硫酯键的两种切割模式——无论是通过蛋白酶捕获期间的构象变化还是通过伯胺攻击——都会导致Cys949处游离硫醇（-SH）基团的暴露。这些基团可以被滴定以评估键的化学计量或分析每个hα2M单体的天然和诱导构象。暴露的硫醇基团还可以与分子反应，如碘乙酰胺，被2,4-二硝基苯基硫氰酸酯（DNPSCN）硫氰化，或与β-氨基丙腈、鸟苷、咪唑和胸苷结合。尽管两种机制都诱导了hα2M四聚体类似的结构变化，但它们在触发构象转变的方式和反应动力学上存在差异。蛋白水解触发快速的构象变化（<15 s），而伯胺攻击导致较慢的转变，持续数分钟甚至数小时，具体取决于胺的浓度。
此外，三级结构略有不同。虽然蛋白酶攻击导致BRD塌陷和由BR触发的构象变化，但小胺攻击似乎削弱了RBD和TED之间的疏水相互作用。在这种情况下，会在先前保护β-半胱氨酰-γ-谷氨酰键的疏水环境中产生极性基团，导致RBD从TED释放，而BRD的BR保持完整。尽管存在这些差异，两种机制都导致C端RBD的暴露，并促进诱导的hα2M四聚体从血液循环中快速清除。
4.3 受体结合域（RBD）暴露和活化hα2M的清除
最后，蛋白酶捕获机制的最后一步涉及hα2M四聚体构象变化后暴露的C端RBD区域的识别。RBD区域结合细胞表面配体，包括低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）和葡萄糖调节蛋白78（
