《The Journal of Physiology》：Photobiomodulation restores blood–brain barrier integrity after hypoxia via endothelial von Willebrand factor modulation in a humanised tricellular transwell model
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本研究聚焦缺氧所致血脑屏障(BBB)功能障碍，探索非侵入性光生物调节(PBM)对体外三细胞血脑屏障模型中内皮细胞vWF/HIF-1α信号通路的调控作用，发现PBM可降低氧化应激、改善线粒体呼吸功能并重塑凝血-炎症网络，为缺血性脑损伤等缺氧相关神经系统疾病的血管保护策略提供新靶点。
在神经科学领域，血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）如同大脑的“边防关卡”，由脑微血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞脚板共同构成，严格控制物质进出中枢神经系统，维持大脑内环境稳定。然而，这一精密防线在急性脑损伤（如缺血性脑卒中、创伤性脑损伤）和慢性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中极易受损——其中，缺氧是导致BBB功能障碍的关键驱动因素。当氧气供应不足时，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）在细胞内稳定表达，触发炎症反应、代谢重编程和血管重塑；同时，线粒体功能障碍导致活性氧（reactive oxygen species, ROS）大量产生，进一步破坏内皮细胞紧密连接蛋白（如zonula occludens-1, ZO-1、claudin-5、occludin）的结构，使BBB变得“千疮百孔”。更棘手的是，缺氧还会上调内皮细胞中的血小板黏附分子von Willebrand因子（von Willebrand factor, vWF），促进白细胞浸润和血栓形成，加剧神经炎症。尽管BBB破坏被视为多种脑疾病的核心病理环节，但目前仍缺乏直接修复屏障功能的靶向疗法。
面对这一困境，研究者将目光投向一种非侵入性物理治疗策略——光生物调节（photobiomodulation, PBM）。PBM利用波长600-1100 nm的红光和近红外光照射组织，被线粒体色素c氧化酶（cytochrome c oxidase, CCO）吸收后，可增强线粒体呼吸链活性、增加ATP合成并调节ROS信号，进而激活细胞抗氧化和抗炎通路。前期动物实验显示，PBM能提升阿尔茨海默病模型小鼠的认知功能，并增加BBB紧密连接蛋白表达；临床研究中，PBM在血管修复和神经系统疾病中也展现出潜力。然而，PBM能否直接逆转缺氧后的BBB损伤？其在多细胞BBB体系中的细胞特异性机制是什么？这些问题尚未得到系统解答。
为填补这一空白，来自牛津大学的研究团队提出假设：PBM并非通过非特异性细胞保护发挥作用，而是通过精准调控内皮细胞的凝血-炎症信号通路来恢复BBB完整性。他们利用永生化人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells, HBMECs）、人星形胶质细胞（human astrocytes, HAs）和人脑血管周细胞（human brain vascular pericytes, HVPCs），构建了仿生理的体外三细胞BBB Transwell模型，模拟缺氧损伤（6 h，1% O2）后给予三次PBM处理（每次5 min，间隔1 h恢复），从屏障功能、分子表达、代谢状态和细胞互作等多维度揭示PBM的作用机制。相关研究成果近期发表于生理学权威期刊《The Journal of Physiology》。
研究团队运用跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）测量评估屏障完整性；采用免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）和定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qPCR）检测紧密连接蛋白、vWF、HIF-1α等分子的表达与定位；通过ROS-Glo H2O2试剂盒量化氧化应激水平；借助Seahorse细胞能量代谢分析系统解析线粒体耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）和胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）；利用人类细胞因子阵列芯片筛选炎症介质变化；并通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲低vWF基因验证其功能角色。
PBM恢复缺氧诱导的体外BBB模型屏障功能障碍
TEER结果显示，缺氧显著降低单层内皮细胞和三细胞共培养模型的电阻值（下降30%-70%，P<0.05），而PBM处理后24 h和48 h，TEER均恢复至接近基线水平（P<0.001）。细胞活力和毒性实验证实，PBM的保护作用不依赖细胞增殖或死亡率的改变。尽管ZO-1 mRNA和蛋白总量未显著变化，但免疫荧光显示PBM能重组缺氧导致的ZO-1分布紊乱，提示其通过修复紧密连接空间结构而非单纯增加蛋白合成来强化屏障。
PBM以细胞特异性方式调节缺氧诱导的氧化应激和HIF-1α信号
ROS检测发现，PBM使缺氧星形胶质细胞的ROS水平立即减半（P<0.01），周细胞经三次照射后ROS亦显著下降（P<0.05）；而内皮细胞中ROS虽无统计学降低，但HIF-1α核转位被明显抑制——缺氧组内皮细胞核内HIF-1α荧光强度较常氧组显著升高，PBM处理后则降低约75%（P<0.05）。星形胶质细胞中HIF-1α亦有下降趋势，但周细胞未见明显改变。这表明PBM对不同细胞类型的氧化还原状态和缺氧信号存在差异化调控。
PBM增强内皮细胞线粒体最大呼吸容量
Seahorse代谢分析揭示，缺氧24 h后，内皮细胞和星形胶质细胞的基础呼吸分别下降58.46%（P<0.01）和69.29%（P<0.05）；PBM虽未显著恢复基础呼吸，但使缺氧内皮细胞的最大呼吸容量（FCCP激发后）提升至接近基线水平（P=0.0753），提示其增强了线粒体应对能量需求激增的储备能力。48 h后各组呼吸参数普遍恢复，唯内皮细胞糖酵解能力低于常氧组（P<0.05），表明缺氧对内皮代谢的冲击最持久。
PBM重塑缺氧BBB模型中的细胞因子和趋化因子网络
细胞因子阵列检测到17种炎症介质，其中6种受PBM显著调节：无论常氧或缺氧，PBM均上调白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）、生长调节致癌基因-α（CXCL1/GROα）和IL-21（P<0.05），同时下调纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1, Serpin E1/PAI-1）和巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）（P<0.05）。这些变化指向PBM可能通过减少促血栓因子（PAI-1）和促炎因子（MIF）、促进血管生成相关趋化因子分泌，营造有利于屏障修复的微环境。
vWF介导PBM对屏障完整性的恢复作用
分子机制探究聚焦内皮细胞vWF——缺氧使其mRNA表达剧增（P<0.001），蛋白水平同样显著上升；PBM则使缺氧内皮细胞的vWF表达回落85.63%（P<0.001），几乎恢复至对照组水平。为验证vWF的功能必要性，研究者用siRNA敲低内皮细胞vWF基因（效率>90%，P<0.0001），发现敲低后PBM不再引起TEER的进一步改善，说明PBM对屏障的修复效应依赖于vWF的下调。
PBM对星形胶质细胞和周细胞经典标志物的影响有限
在星形胶质细胞中，水通道蛋白4（aquaporin-4, AQP4）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表达不受缺氧或PBM显著影响；周细胞的PDGFRβ蛋白在缺氧后呈下降趋势但未达统计显著性，其上游调节因子Rgs5 mRNA则显著下调（P<0.01）。有趣的是，PBM虽未改变周细胞α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, αSMA）转录水平，但免疫荧光显示其能减轻缺氧导致的肌动蛋白丝聚集，促进细胞骨架有序排列，暗示其对周细胞结构的间接稳定作用。
综合以上结果，研究团队得出结论：在缺氧损伤的体外BBB模型中，PBM通过多细胞协同作用恢复屏障功能——对内皮细胞，它抑制HIF-1α/vWF凝血-炎症轴，提升线粒体能量储备；对星形胶质细胞和周细胞，它有效清除ROS、维护细胞骨架稳定性；最终通过下调促血栓因子PAI-1和促炎因子MIF、上调促修复趋化因子，重塑局部免疫微环境。尤为关键的是，vWF被确认为PBM发挥屏障保护作用的必要介质，这为开发针对内皮激活的精准干预策略提供了分子靶点。
这项研究的核心意义在于，首次在人源化多细胞BBB体系中系统阐明PBM修复缺氧后屏障损伤的机制，突破了以往“泛细胞保护”的模糊认知，将作用机理精确锚定在内皮细胞特异性信号通路上。虽然体外模型无法完全模拟体内血流剪切力和免疫细胞互作等复杂因素，且PBM的临床转化仍需解决颅骨透光率、照射剂量标准化等问题，但其揭示的vWF/PAI-1/MIF调控网络，为缺血性脑卒中、创伤性脑损伤等缺氧相关脑病的血管保护提供了新思路：未来或可联合PBM与靶向vWF的药物，实现“物理+分子”双重修复，为守护大脑“边防”开辟更广阔的疗愈前景。
